為探究小鼠睪丸組織中維生素D受體（VDR）對(duì)硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD-1）基因表達(dá)的影響,首先對(duì)6月齡、12月齡野生型和VDR敲除型小鼠睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)VDR敲除后SCD-1基因表達(dá)顯著降低,并通過RT-qPCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。隨后構(gòu)建了融合表達(dá)載體pEGFP-VDR,在293T細(xì)胞中檢測(cè)VDR的定位。接著將pEGFP-VDR和pCDNA3.1-VDR重組質(zhì)粒以及VDR特異性siRNA分別轉(zhuǎn)染至睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3,利用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)過表達(dá)和干擾VDR表達(dá)對(duì)SCD-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,VDR敲除后,睪丸組織中SCD-1的表達(dá)量在6月齡和12月齡小鼠中均極顯著下降;EGFP的核內(nèi)分布因核轉(zhuǎn)錄因子VDR介導(dǎo)的作用明顯多于細(xì)胞質(zhì);TM3細(xì)胞中過表達(dá)VDR對(duì)SCD-1基因表達(dá)無顯著差異,干擾VDR后,SCD-1轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,但蛋白水平差異不顯著。據(jù)此認(rèn)為,正常水平的VDR對(duì)于SCD-1基因表達(dá)和功能維持是必要的, VDR缺失會(huì)嚴(yán)重影響SCD-1的功能,研究結(jié)果為VDR調(diào)控SCD-1基因表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ),為VDR與脂代謝及雄性... 

【文章來源】：動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2020,41(12)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

pEGFP-VDR融合表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

pEGFP-VDR融合表達(dá)載體驗(yàn)證

TM3細(xì)胞為睪丸間質(zhì)細(xì)胞,負(fù)責(zé)合成分泌雄性激素,促進(jìn)精子發(fā)生和雄性生殖器官發(fā)育,故以其為研究對(duì)象,分別進(jìn)行了VDR過表達(dá)和干擾試驗(yàn),分析調(diào)控VDR對(duì)SCD-1基因表達(dá)的影響(圖4和5)。采用pCDNA3.1-VDR和pEGFP-VDR 2個(gè)VDR過表達(dá)載體進(jìn)行分析,是為了確認(rèn)EGFP和VDR融合后是否影響VDR功能。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,pEGFP-VDR和pCDNA3.1-VDR均在TM3細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)VDR的過表達(dá)(圖4A、B和C)。在確認(rèn)VDR過表達(dá)后,進(jìn)行了SCD-1的表達(dá)水平檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在TM3細(xì)胞中過表達(dá)VDR后,SCD-1 mRNA和蛋白水平均略有上升,但與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖4D、E和4F)。本研究設(shè)計(jì)3條VDR si-RNA進(jìn)行VDR干擾試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)si-VDR-Mus-1379、si-VDR-Mus-991和si-VDR-Mus-1204的干擾效率分別為47.7%、40%及18%(圖5A),干擾效率最高的si-VDR-Mus-991組VDR蛋白表達(dá)水平下降24%((圖5B、圖5C)。對(duì)VDR干擾效率較好的2組細(xì)胞進(jìn)行SCD-1表達(dá)水平分析,發(fā)現(xiàn)si-VDR-Mus-1379組水平顯著下降,si-VDR-Mus-991組水平下降極顯著(圖5D),對(duì)si-VDR-Mus-991組SCD-1蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),蛋白表達(dá)降低,但與對(duì)照組比較差異不顯著(圖5E、圖5F)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]VDR對(duì)雄性小鼠生殖與脂代謝影響及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控研究[D]. 劉歡.陜西理工大學(xué) 2019



本文編號(hào)：3614512