發(fā)布時間：2022-01-25 19:19

　　試驗旨在獲得高純度犬降鈣素原（procalcitonin,PCT）重組蛋白,并對該蛋白的臨床應(yīng)用進(jìn)行分析。采用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的方法,將PCT基因克隆至原核表達(dá)載體pET-30a（+）中,經(jīng)雙酶切和測序鑒定陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞,以終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),采用鎳柱進(jìn)行重組蛋白的純化,純化蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,間接ELISA法檢測抗體效價,Western blotting檢測重組蛋白與犬PCT多克隆抗體的特異性,采用ELISA法檢測健康犬和炎癥犬血清PCT。雙酶切及測序結(jié)果顯示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出現(xiàn)堿基突變;SDS-PAGE結(jié)果顯示,重組蛋白以可溶性形式表達(dá),分子質(zhì)量為14.9 ku,間接ELISA法測定的免疫小鼠血清抗體效價達(dá)1∶51 200。Western blotting結(jié)果表明,制備的多抗血清具有很好的特異性;ELISA結(jié)果顯示,炎癥犬血清內(nèi)檢測到PCT,且其濃度與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。結(jié)果表明,本研究成功制備了犬PCT蛋白多克隆抗體,且犬血清PCT蛋白是一種潛在的新型嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥感染指示... 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的基因與原核表達(dá)載體pET-30a(+)連接構(gòu)建重組表達(dá)載體,重組表達(dá)載體pET-30a-PCT用BamH Ⅰ和Nde Ⅰ進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物,在5 270和350 bp處各有一條清晰的條帶(圖2),與預(yù)期片段大小相符。測序結(jié)果顯示,犬PCT基因成功插入pET-30a(+),無突變移碼。2.2 重組蛋白的表達(dá)及驗證

取陽性重組菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行15% SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示,28 ℃、IPTG終濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)9 h后在上清中發(fā)現(xiàn)14.9 ku的明顯條帶,且與預(yù)期大小相符,空質(zhì)粒無條帶出現(xiàn),說明犬PCT蛋白在這一誘導(dǎo)條件下可溶性表達(dá)較高(圖3A)。隨后,以抗His標(biāo)簽的抗體作為一抗進(jìn)行Western blotting分析,結(jié)果顯示,在14.9 ku處出現(xiàn)一條明顯的反應(yīng)條帶(圖3B),表明His-PCT重組蛋白能夠表達(dá)。2.3 重組蛋白的純化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雞傳染性支氣管炎病毒HH06株囊膜蛋白多克隆抗體制備及生物學(xué)功能檢測[J]. 白妍,趙蕾,杜威威,潘龍,黃小丹,楊貴君,李廣興.  中國畜牧獸醫(yī). 2016(08)
[2]奶牛早孕因子重組蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[J]. 劉云,賈斌,石峰,李鑫,李洪濤,張永生,寧夢影,紀(jì)俊明,秦炳燕.  中國畜牧獸醫(yī). 2015(04)
[3]降鈣素原基因克隆表達(dá)及多克隆抗體的制備[J]. 譚倩,田衛(wèi)群,王禮,彭威,陳凡.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2013(05)
[4]一種高效、穩(wěn)定的可溶性原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J]. 高閃電,常惠蕓,獨軍政,叢國正,邵軍軍,林彤.  華北農(nóng)學(xué)報. 2009(06)
[5]細(xì)粒棘球絳蟲重組pET30a-EgA31疫苗的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)[J]. 賈海英,馬海梅,丁劍冰,曹春寶,吾拉木·馬木提,馬秀敏,張海濤,朱明,呂國棟,溫浩.  科技導(dǎo)報. 2009(08)
[6]基因重組降鈣素原蛋白在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及純化[J]. 陳潔,張志萍,謝惠芳.  檢驗醫(yī)學(xué). 2008(03)
[7]大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)重組蛋白的研究[J]. 陸海,吳薇,曾慶銀,李義,蔣湘寧,王沙生.  北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2001(06)



本文編號：3609069