乳腺是動物成年后經歷增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機理的研究對提高奶牛的生產性能及乳品質非常重要。microRNAs是一類在轉錄后調節(jié)基因表達的短的非編碼RNA。從microRNA的角度研究其對奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機理的調控是一個較新的研究領域。本試驗選取在奶牛分娩前后有差異表達的bta-miR-145為研究對象，通過生物信息學分析、文獻報道比較、3’RACE測序、細胞轉染、RT-qPCR、Western Blotting、雙熒光報告分析等方法在牛乳腺上皮細胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究內容如下：1.為了挖掘更多的與bta-miR-145相關的信息，對bta-miR-145進行了生物信息學分析。通過MEGA5.05軟件對牛的bta-mir-145進行種系發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)牛與人和豬的microRNA145同源關系較近；通過miR TarBase數(shù)據(jù)對miR-145進行已驗證靶標收集，發(fā)現(xiàn)在人和小鼠上miR-145靶向IRS1；將Target Scan6.2預測的bta-miR-145的648個靶標帶入DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)大部分靶... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
表目錄
圖目錄
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 研究目的和意義
    1.2 國內外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 microRNA 的概述
        1.2.2 與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳相關的 microRNA 的研究進展
        1.2.3 bta-miR-145 的研究進展
        1.2.4 bta-miR-145 的生物信息學分析
    1.3 研究內容和技術路線
        1.3.1 研究內容
        1.3.2 技術路線
第二章 牛 IRS1 基因的 3′RACE 測序及結合位點分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取
        2.1.2 已知序列驗證
        2.1.3 3 ′端序列獲取
        2.1.4 RACE 序列驗證
        2.1.5 序列拼接
        2.1.6 對測得的 IRS13’RACE 序列進行生物信息學分析
    2.2 結果與分析
        2.2.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取結果
        2.2.2 已知序列驗證結果
        2.2.3 3 ′端序列獲取結果
        2.2.4 RACE 序列驗證結果
        2.2.5 用 Sequencher 4.9 軟件對上述測得的序列進行拼接的結果
        2.2.6 對測得的 IRS13’RACE 序列進行生物信息學分析結果
    2.3 討論
    2.4 結論
第三章 奶牛乳腺上皮細胞系的建立及β-酪蛋白的誘導表達
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要設備、試劑、耗材
        3.1.2 培養(yǎng)液
        3.1.3 奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)
        3.1.4 奶牛乳腺上皮細胞的純化
        3.1.5 奶牛乳腺上皮細胞的角蛋白-18 鑒定
        3.1.6 奶牛乳腺上皮細胞的凍存與復蘇
        3.1.7 奶牛乳腺上皮細胞生長曲線的繪制
        3.1.8 奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的誘導表達
    3.2 結果與分析
        3.2.1 奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)
        3.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的純化
        3.2.3 奶牛乳腺上皮細胞生長曲線
        3.2.4 免疫細胞熒光染色法鑒定乳腺上皮細胞角蛋白-18 的表達
        3.2.5 奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的誘導表達結果
    3.3 討論
    3.4 結論
第四章 bta-miR-145 mimic、inhibitor 轉染條件的摸索及對細胞活力的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 轉染前細胞接種密度的摸索
        4.1.2 轉染時 RNAi 與脂質體 2000 的最適添加量
        4.1.3 qPCR 檢測轉染后 miR-145 過表達和抑制表達的效果
        4.1.4 轉染后的細胞活力檢測
        4.1.5 miR-145 過表達和抑制表達后對的其它幾種 microRNA 基因表達的影響
    4.2 結果與分析
        4.2.1 轉染前細胞接種密度的摸索結果
        4.2.2 轉染時 RNAi 與脂質體 2000 的最適添加量及轉染效率
        4.2.3 qPCR 檢測牛乳腺上皮細胞中 miR-145 過表達和抑制表達的效果
        4.2.4 轉染后的細胞活力檢測結果
        4.2.5 miR-145 過表達和抑制表達對其它幾種 microRNA 的影響
    4.3 討論
    4.4 結論
第五章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的 RT-qPCR 驗證及 Western Blot 驗證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 細胞處理和瞬時轉染
        5.1.2 樣品 RNA 提取、反轉錄及熒光定量反應
        5.1.3 Western Blot 試驗的主要設備、試劑、耗材
        5.1.4 細胞蛋白樣品的制備
        5.1.5 SDS-PAGE 電泳
        5.1.6 轉膜
        5.1.7 封閉、抗體孵育和顯色
    5.2 結果與分析
        5.2.1 過表達對預測靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達的影響
        5.2.2 抑制表達對預測靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達的影響
        5.2.3 BCA 法測定蛋白濃度標準曲線繪制
        5.2.4 SDS-PAGE 膠考馬斯亮蘭的染色結果
        5.2.5 麗春紅染膜的結果
        5.2.6 轉染后牛乳腺上皮細胞中 IRS1 和 CSN2 蛋白表達的變化
    5.3 討論
    5.4 結論
第六章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的雙熒光報告基因檢測
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要設備、試劑、耗材
        6.1.2 牛乳腺組織 RNA 的提取和反轉錄
        6.1.3 牛重組載體 CSN2-WT 和 IRS1-WT 的構建
        6.1.4 雙熒光素酶報告載體分析 miRNA 作用靶點
    6.2 結果與分析
        6.2.1 基因 3’UTR PCR 擴增結果
        6.2.2 重組載體菌液 PCR、雙酶切和測序結果
        6.2.3 雙熒光素酶表達分析結果
    6.3 討論
    6.4 結論
第七章 全文結論
    7.1 結論
    7.2 本試驗創(chuàng)新點
    7.3 有待于進一步研究的問題
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3603984