乳腺是動(dòng)物成年后經(jīng)歷增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機(jī)理的研究對(duì)提高奶牛的生產(chǎn)性能及乳品質(zhì)非常重要。microRNAs是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短的非編碼RNA。從microRNA的角度研究其對(duì)奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機(jī)理的調(diào)控是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域。本試驗(yàn)選取在奶牛分娩前后有差異表達(dá)的bta-miR-145為研究對(duì)象，通過(guò)生物信息學(xué)分析、文獻(xiàn)報(bào)道比較、3’RACE測(cè)序、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RT-qPCR、Western Blotting、雙熒光報(bào)告分析等方法在牛乳腺上皮細(xì)胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究?jī)?nèi)容如下：1.為了挖掘更多的與bta-miR-145相關(guān)的信息，對(duì)bta-miR-145進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過(guò)MEGA5.05軟件對(duì)牛的bta-mir-145進(jìn)行種系發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)牛與人和豬的microRNA145同源關(guān)系較近；通過(guò)miR TarBase數(shù)據(jù)對(duì)miR-145進(jìn)行已驗(yàn)證靶標(biāo)收集，發(fā)現(xiàn)在人和小鼠上miR-145靶向IRS1；將Target Scan6.2預(yù)測(cè)的bta-miR-145的648個(gè)靶標(biāo)帶入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)大部分靶... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：104 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
表目錄
圖目錄
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 研究目的和意義
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 microRNA 的概述
        1.2.2 與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的 microRNA 的研究進(jìn)展
        1.2.3 bta-miR-145 的研究進(jìn)展
        1.2.4 bta-miR-145 的生物信息學(xué)分析
    1.3 研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線
        1.3.1 研究?jī)?nèi)容
        1.3.2 技術(shù)路線
第二章 牛 IRS1 基因的 3′RACE 測(cè)序及結(jié)合位點(diǎn)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取
        2.1.2 已知序列驗(yàn)證
        2.1.3 3 ′端序列獲取
        2.1.4 RACE 序列驗(yàn)證
        2.1.5 序列拼接
        2.1.6 對(duì)測(cè)得的 IRS13’RACE 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 牛乳腺組織 Total RNA 提取結(jié)果
        2.2.2 已知序列驗(yàn)證結(jié)果
        2.2.3 3 ′端序列獲取結(jié)果
        2.2.4 RACE 序列驗(yàn)證結(jié)果
        2.2.5 用 Sequencher 4.9 軟件對(duì)上述測(cè)得的序列進(jìn)行拼接的結(jié)果
        2.2.6 對(duì)測(cè)得的 IRS13’RACE 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 結(jié)論
第三章 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要設(shè)備、試劑、耗材
        3.1.2 培養(yǎng)液
        3.1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化
        3.1.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的角蛋白-18 鑒定
        3.1.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        3.1.7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制
        3.1.8 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化
        3.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
        3.2.4 免疫細(xì)胞熒光染色法鑒定乳腺上皮細(xì)胞角蛋白-18 的表達(dá)
        3.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 結(jié)論
第四章 bta-miR-145 mimic、inhibitor 轉(zhuǎn)染條件的摸索及對(duì)細(xì)胞活力的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞接種密度的摸索
        4.1.2 轉(zhuǎn)染時(shí) RNAi 與脂質(zhì)體 2000 的最適添加量
        4.1.3 qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 miR-145 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的效果
        4.1.4 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力檢測(cè)
        4.1.5 miR-145 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)后對(duì)的其它幾種 microRNA 基因表達(dá)的影響
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞接種密度的摸索結(jié)果
        4.2.2 轉(zhuǎn)染時(shí) RNAi 與脂質(zhì)體 2000 的最適添加量及轉(zhuǎn)染效率
        4.2.3 qPCR 檢測(cè)牛乳腺上皮細(xì)胞中 miR-145 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的效果
        4.2.4 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果
        4.2.5 miR-145 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)其它幾種 microRNA 的影響
    4.3 討論
    4.4 結(jié)論
第五章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的 RT-qPCR 驗(yàn)證及 Western Blot 驗(yàn)證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 細(xì)胞處理和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        5.1.2 樣品 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量反應(yīng)
        5.1.3 Western Blot 試驗(yàn)的主要設(shè)備、試劑、耗材
        5.1.4 細(xì)胞蛋白樣品的制備
        5.1.5 SDS-PAGE 電泳
        5.1.6 轉(zhuǎn)膜
        5.1.7 封閉、抗體孵育和顯色
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 過(guò)表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達(dá)的影響
        5.2.2 抑制表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因 CSN2 和 IRS1 mRNA 表達(dá)的影響
        5.2.3 BCA 法測(cè)定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        5.2.4 SDS-PAGE 膠考馬斯亮蘭的染色結(jié)果
        5.2.5 麗春紅染膜的結(jié)果
        5.2.6 轉(zhuǎn)染后牛乳腺上皮細(xì)胞中 IRS1 和 CSN2 蛋白表達(dá)的變化
    5.3 討論
    5.4 結(jié)論
第六章 bta-miR-145 靶向 IRS1、CSN2 的雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)
    6.1 材料與方法
        6.1.1 主要設(shè)備、試劑、耗材
        6.1.2 牛乳腺組織 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄
        6.1.3 牛重組載體 CSN2-WT 和 IRS1-WT 的構(gòu)建
        6.1.4 雙熒光素酶報(bào)告載體分析 miRNA 作用靶點(diǎn)
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 基因 3’UTR PCR 擴(kuò)增結(jié)果
        6.2.2 重組載體菌液 PCR、雙酶切和測(cè)序結(jié)果
        6.2.3 雙熒光素酶表達(dá)分析結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 結(jié)論
第七章 全文結(jié)論
    7.1 結(jié)論
    7.2 本試驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 有待于進(jìn)一步研究的問(wèn)題
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3603984