大腸桿菌Nissle 1917（EcN）是一種革蘭氏陰性益生菌,因其對腸道疾病有顯著的緩解效果而被廣泛用于臨床治療中。它能夠通過其分泌胞外囊泡調節(jié)宿主腸上皮細胞的免疫反應。巨噬細胞是固有免疫反應中的重要免疫細胞,然而關于EcN與巨噬細胞互作報道甚少。鑒于此,本試驗旨在通過分離EcN的胞外囊泡（EcN_OMVs）探究其對巨噬細胞生物功能的調節(jié)作用,并利用蛋白組學技術進一步挖掘影響巨噬細胞功能的潛在免疫信號分子,為EcN在動物腸道中的免疫調節(jié)機制提供理論基礎。試驗包括兩部分:（1）首先利用差速離心和梯度密度離心法分離和純化EcN_OMVs,用激光納米顆粒分析儀分析其粒徑大小及分布,透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)結構;利用激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞對EcN_OMVs的內在化;用玻璃珠涂板法測定巨噬細胞吞噬病原性大腸桿菌的數量以探究EcN_OMVs對巨噬細胞殺菌能力的影響。然后分別用PBS（對照組）、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL EcN_OMVs刺激RAW264.7... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

EcN的表性特征示意圖(Mohamedetal.,2010)

圖 1-2 OMVs 的形成模型示意圖 (Mashburn-Warren and Whiteley, 2006)Fig 1-2 The biogenesis of OMVs1.3.2 細菌胞外囊泡負載的分子胞外囊泡作為一種生物間通訊的載體分子，向胞外分泌時能夠攜帶 LPS、蛋白質、脂質、核酸和其他毒力因子。在早期的報道中，通過生化分析包括聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡技術能夠發(fā)現胞外囊泡攜帶的外膜蛋白（OmpA、OmpC and OmpF）、周質蛋白（堿性磷酸酶和 AcrA）和毒力因子（粘附素、侵襲素和其他酶類）(Lee eal., 2008)。了解這些蛋白質的功能，將有助于闡明 OMVs 的形成機制和生物功能。在過去的幾年里，基于質譜分析的蛋白組學研究已經能夠發(fā)現 3500 多種囊泡蛋白(Kimet al., 2013)。Evpedia 是一個收列了胞外囊泡相關性文章和囊泡蛋白高通量數據的網站(Kim et al.,2013 )。此網站提供了完整的生物信息分析工具（搜索和瀏覽囊泡成分、基因本體富集分析、囊泡蛋白和 mRNA 的網絡分析、囊泡數據集的同源性鑒定比較），以系統(tǒng)分析真核和原核生物胞外囊泡負載的分子組成，進而闡明這些復雜細胞外囊泡的新功能。除了蛋白質，胞外囊泡中還存在較豐富的脂質。雖然脂類是革蘭氏陰性菌胞外囊

圖 2-1 EcN_OMVs 的分離Fig 2-1 Isolation of EcN_OMVsA：超速離心獲得 OMVs；B：激光納米顆粒分析儀檢測 EcN_OMVs 粒徑分布。A: OMVs precipitation was obtained by ultracentrifugation; B: Size distribution of EcN_OMVsas determined by nanoparticle tracking analysis. EcN_OMVs 的純化獲得高純度的 EcN_OMVs，對超速離心得到的 OMVs 進行密度梯度離心，得到密度層的 OMVs，分別測定這 11 個密度層 EcN_OMVs 的濃度和粒徑大�。ū� 2-1）。層的 OMVs 的濃度及粒徑大小存在差異，其中，濃度最高的是第 5 層，為 2.26×/mL，對應的峰值為 115.0 nm。計算各層 EcN_OMVs 相對豐度，結果（圖 2-2示 EcN_OMVs 濃度峰值在 F 5，為了滿足試驗需求，選擇 F 4-F 6（濃度梯度在30%）的密度層再次進行超速離心富集得到純化的 EcN_OMVs。激光納米顆粒檢測純化后的 EcN_OMVs 如圖 2-2 B 所示，分布圖線條平滑，且只有一個峰值，1.5 nm，表明獲得粒徑較均一的高純度 OMVs。表 2-1 密度梯度離心后各層 EcN_OMVs 濃度及粒徑大小ble 2-1 Concentration and size of EcN_OMVs of each layer after density gradient centrifugation

【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌鞭毛運動、黏附和免疫逃逸機制的研究進展[J]. 許綿,周明旭,朱國強.  中國獸醫(yī)學報. 2017(02)
[2]植物應答非生物脅迫的蛋白質組學研究進展[J]. 付晨熙,肖自華,高飛,周宜君.  基因組學與應用生物學. 2016(12)
[3]口服益生菌Escherichia coli Nissle 1917調控斷奶仔豬空腸黏膜屏障功能的機理研究[J]. 唐志如,鄧歡,孫衛(wèi)忠,張小龍,張翥.  畜牧獸醫(yī)學報. 2014(01)



本文編號：3602585