近幾年來,臨床上表現(xiàn)為多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎的病豬屢見不鮮,從患病豬的病理臟器中分離出副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,HPS）的比例越來越高,但對其致病機理尚不清楚。本研究選取2株副豬嗜血桿菌血清4型菌株進行比較蛋白質(zhì)組學和免疫蛋白質(zhì)組學研究,以揭示其致病機制。1副豬嗜血桿菌二維雙向凝膠電泳條件的建立和優(yōu)化本研究主要對裂解液配方、上樣量以及聚焦時間進行優(yōu)化,建立了適宜的副豬嗜血桿菌二維雙向電泳凝膠技術(shù)。通過超聲-裂解液-離心法提取全蛋白,裂解液配方為7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,40mMDTT,2%IPGbuffer。上樣時使用2D clean-up kit以及加入去拖尾DeStreak試劑。采用銀染方法確定了 24cm膠條上樣量為5000μg。一向等電聚焦程序為:30V12h、100V2h、200Vlh、500V lh、1000V3h、2000V 2h、8000V3h、60000 Vh、500V10h。2副豬嗜血桿菌血清4型菌株的差異蛋白質(zhì)組學研究先通過二維雙向凝膠電泳技術(shù)和PDQest8.0軟件分析獲取23個差異表達蛋白,再運用MALDI-TOF-... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學福建省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－２副豬嗜血桿菌的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖譜??

?ｐＨ４?—７??Ｋ?剩??８Ｍ尿素裂解液制備樣品的２－Ｄ圖諳?７Ｍ尿素裂解液制備樣品的２－Ｄ圖諧??圖２－３不同蛋白裂解液提取樣品的雙向電泳圖譜??Ｆｉｇ．?２－３?２－Ｄ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｙｓｉｓ?ｂｕｆｆｅｒ??蛋白樣品的有效溶解是雙向電泳成功分離蛋白質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，裂解液中??尿素作為常用的變性劑，其常用濃度為８Ｍ，過低則不能達到完全溶解蛋白的目??的。硫脲的添加則可以幫助許多難溶蛋白進行溶解，特別是膜蛋白，二者共同作??用能夠破壞蛋白分子間的氫鍵，從而防止由氫鍵引起蛋白質(zhì)聚集以及蛋白遷移中??二級結(jié)構(gòu)的形成。由于硫脲在水中的溶解度低，高濃度尿素可增強其溶解度，因??此通常選用７Ｍ尿素和２Ｍ硫脲的混合溶液。??如上圖，相同的上樣量和聚焦程序，使用８Ｍ尿素裂解液不能徹底溶解樣品??中的蛋白，在酸性端出現(xiàn)大量水平拖尾現(xiàn)象，蛋白點不能很好分開；使用７Ｍ尿??素裂解液

未用試劑盒處理的樣品?用試劑盒處理的樣品??圖２－４用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ試劑盒對樣品處理前后的雙向電泳圖譜??Ｆｉｇ．?２－４?Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｇｅｓ?ｏｆ?ｂｅｆｏｒｅ?ａｎｄ?ａｆｔｅｒ?ｕｓｉｎｇ?２－Ｄ??ｃｌｅａｎ?ｕｐ?ｋｉｔ??雙向電泳對蛋白樣品的要求非常嚴格，樣品中任何雜質(zhì)都會對后續(xù)的等點聚??焦過程產(chǎn)生影響。用２－Ｄ?ｄｅａｎ?ｕｐ試劑盒對樣品處理前后的雙向電泳結(jié)果比較發(fā)??現(xiàn)，未用試劑盒處理的樣品中含有少量雜質(zhì)，出現(xiàn)水平條紋，部分蛋白溶解度差??影響了電泳的分辨率；用試劑盒處理的樣品，因去除了樣品中各種去污劑、鹽份、??多肽、核酸、脂類、酚類和其他一些離子，保持了樣品的溶解性，減少了水平條??紋的發(fā)生，提高了電泳的分辨率，圖譜中蛋白點清晰、聚焦效果很好，而且使用??試劑盒沒有造成斑點的增加或減少，或斑點位置變化，明顯使用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ試??劑盒處理樣品的圖譜要好于沒有用試劑盒處理的圖譜。因此，在開始雙向電泳前??需先用２－Ｄ?ｃｌｅａｎ?ｕｐ試劑盒來處理樣品。??３．５樣品上樣量的確定（２４ｃｍ）??采用２根２４ｃｍ膠條

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3598882