肌肉和脂肪是影響豬肌肉品質(zhì)重要因素,提高肌肉品質(zhì)是育種工作者的重要目標之一,隨著分子生物學的發(fā)展,豬的育種技術已從常規(guī)育種逐漸向分子育種的方向過渡。因此,了解影響豬肌肉和脂肪組織的相關基因的轉錄調(diào)控機理,有助于為分子育種打下良好的基礎。為此,我們做了如下研究：（1）通過5’RACE鑒定了豬BMP-3b基因的轉錄起始位點,發(fā)現(xiàn)該基因的轉錄起始位點翻譯起始位點上游278bp處的鳥嘌呤,并將其定為+1。（2）通過NCBI和EBI獲得了豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控序列,我們克隆了該基因5’端上游調(diào)控序列1458bp。利用生物信息學的方法預測了豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控區(qū)域,發(fā)現(xiàn)了TATA-box和GC-box,預測到了多個與脂肪相關的C/EBP轉錄因子結合位點。并比較不同物種的近端啟動區(qū),發(fā)現(xiàn)在-51--36bp處高度保守,該區(qū)域位于兩個GC-box中。（3）構建了8段5’端系列缺失片段的雙熒光素酶報告基因載體,并在3種真核細胞系中檢測了它們的熒光活性,并對活性較高的PF2段缺失又進行了5段缺失,同樣檢測它們的熒光活性,發(fā)現(xiàn)在-46--39可能是該基因的核心區(qū)域。（4）通過點突變的方... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 前言
    2 豬脂肪相關基因的研究進展
        2.1 二�；视王；D移酶1
        2.2 激素敏感性脂肪酶
        2.3 脂蛋白酯酶基因
        2.4 過氧化物酶體增殖物激活受體γ
    3 啟動子的結構功能研究
        3.1 啟動子基本結構
        3.2 真核生物啟動子預測相關數(shù)據(jù)庫
        3.3 真核生物啟動子功能研究
    4 DNA甲基化
        4.1 表觀遺傳學的相關研究
        4.2 DNA甲基化的修飾模式
        4.3 DNA甲基化的檢測方法
    5 BMP-3b基因研究進展
    6 研究的目的和意義
第二章 實驗材料和方法
    1 試驗材料
        1.1 主要的生化試劑和藥品
        1.2 細胞、菌株和載體及豬基因組DNA
        1.3 試劑盒
        1.4 組織表達譜分析的樣品
        1.5 DNA甲基化分析的樣品
        1.6 主要的儀器、設備及耗材
        1.7 緩沖液和常用試劑的配制
        1.8 主要的生物學軟件和網(wǎng)站
    2 試驗方法
        2.1 豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控區(qū)域的克隆和分析
        2.2 豬BMP-3b基因轉錄起始位點的鑒定
        2.3 豬BMP-3b基因近端啟動子缺失分析
        2.4 核心啟動區(qū)的進一步尋找和驗證
        2.5 定點突變的驗證試驗
        2.6 豬BMP-3b基因組織表達譜分析
        2.7 核心啟動區(qū)甲基化研究
        2.8 BMP-3b超表達實驗
第三章 實驗結果與分析
    1 豬BMP-3b基因啟動子核心位點的尋找
        1.1 豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控區(qū)域克隆和分析
        1.2 豬BMP-3b基因轉錄起始位點的鑒定
        1.3 豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控區(qū)域的生物信息學分析
        1.4 不同物種BMP-3b基因近端啟動子序列比對
        1.5 豬BMP-3b基因5’端上游調(diào)控區(qū)域的缺失載體的構建
        1.6 啟動子在三種不同真核細胞中活性分析結果
        1.7 細致缺失載體的構建
        1.8 細致缺失片段在PK細胞中的活性分析
        1.9 點突變分析的驗證
    2 豬BMP-3b基因組織表達譜分析
        2.1 RNA的提取
        2.2 第一鏈cDNA檢測結果
        2.3 豬BMP-3b基因在豬不同組織中的表達結果
    3 核心啟動區(qū)甲基化分析
        3.1 豬BMP-3b基因啟動子和外顯子CpG島預測
        3.2 核心啟動區(qū)的甲基化擴增結果
        3.3 甲基化測序結果與分析
        3.4 豬BMP-3b基因核心啟動區(qū)不同時期的甲基化情況
        3.5 豬BMP-3b基因組織表達與甲基化相關性分析
    4 豬BMP-3b的超表達實驗
        4.1 不同物種BMP-3b基因氨基酸序列比對
        4.2 豬BMP-3b基因CDS全長的克隆及雙酶切鑒定
        4.3 PCDNA3.1-CDS在PK細胞中的轉染
        4.4 熒光定量PCR檢測結果
第四章 討論
    1 關于豬BMP-3b基因生物信息學與轉錄調(diào)控分析
        1.1 豬BMP-3b基因序列分析
        1.2 豬BMP-3b基因啟動子的轉錄調(diào)控分析
    2 豬BMP-3b基因啟動子甲基化與組織表達譜分析
    3 豬BMP-3b基因的超表達實驗分析
第五章 小結
    1 本實驗得到的結論
    2 下一步工作設想
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]真核生物啟動子的鑒定方法[J]. 石慧,李建遠.  中外醫(yī)學研究. 2012(08)
[2]真核生物啟動子的研究及應用[J]. 黃玉,楊波,遲小華,劉麗宏,李薇,盧學春.  生物技術通訊. 2010(02)
[3]啟動子序列克隆和功能分析方法的研究進展[J]. 楊曉娜,趙昶靈,李云,李會容,蘇麗,周燕瓊.  云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2010(02)
[4]豬脂肪性狀相關基因的研究進展[J]. 李培培,戈新,王建華,張寶珣,江科,曲明祥.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(01)
[5]表觀遺傳學的分子機制及其研究進展[J]. 孫永健,陳小強,孫寧,張磊.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2008(33)
[6]飼糧營養(yǎng)水平對豬血液生化指標、背最長肌IMF含量及LPLmRNA表達量的影響[J]. 廉紅霞,盧德勛,高民.  中國飼料. 2008(05)
[7]豬激素敏感脂肪酶基因外顯子1的遺傳多態(tài)性分析[J]. 薛慧良,徐來祥.  細胞生物學雜志. 2007(05)
[8]DNA甲基化——腫瘤產(chǎn)生的一種表觀遺傳學機制[J]. 張麗麗,吳建新.  遺傳. 2006(07)
[9]啟動子克隆概述[J]. 孫曉紅,陳明杰,潘迎捷.  食用菌學報. 2002(03)

博士論文
[1]豬PPARΓ2基因肌肉超表達真核表達載體構建以及在轉基因小鼠中的功能驗證[D]. 黃錦亮.華中農(nóng)業(yè)大學 2012
[2]豬肌肉發(fā)育相關基因Six1與Pitx2c的分離克隆、表達模式及功能研究[D]. 吳望軍.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
[3]大白×梅山豬雜交組合親子代間脂肪組織差異表達基因的分離和功能初步研究[D]. 任竹青.華中農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3598744