目的：內(nèi)參基因作為RT-PCR反應(yīng)體系中的內(nèi)源性參照,起到標(biāo)準(zhǔn)化對定量數(shù)據(jù)的重要作用。但是在PRRSV感染條件下的骨髓中,常見內(nèi)參基因表達(dá)有可能發(fā)生改變,因此需要篩選穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參。本實(shí)驗室建立了PRRSV感染骨髓組織的數(shù)字化基因表達(dá)譜,通過生物信息學(xué)分析篩選得到差異表達(dá)的基因酸性神經(jīng)酰胺酶ASAH1,并初步探索PRRSV感染過程中ASAH1與病毒和宿主的相互作用,為更好地理解PRRSV感染的分子機(jī)理提供參考。方法：采用熒光定量技術(shù)檢測9個常用內(nèi)參基因在PRRSV感染骨髓中的表達(dá)差異,并應(yīng)用geNorm軟件評估基因的表達(dá)穩(wěn)定性；采用熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)檢測ASAH1基因在PRRSV感染條件下表達(dá)水平的影響。結(jié)果：在PRRSV感染的骨髓組織中,β-actin是表達(dá)最穩(wěn)定的基因,而Bm2是表達(dá)最不穩(wěn)定的基因,穩(wěn)定性由高到低依次為β-actin>GAPDH>SDHA>5S>18S>TOP2B> HPRT>PKGl>Bm2;差異表達(dá)的基因ASAH1,在數(shù)字化基因表達(dá)譜中顯著上調(diào)：熒光定量PCR結(jié)果顯示ASAH1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

總RNA提取電泳圖

圖1總RNA提取電泳圖Fig. 1 Total RNA extracted1.1.2 內(nèi)參基因?qū)崟r焚光定量結(jié)果2_aact法應(yīng)用的前提是目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，理論上PCR擴(kuò)增是遞增的，以2的倍數(shù)向上遞增，這時的擴(kuò)增率是100%，但是實(shí)際上的實(shí)驗不能保證擴(kuò)增效率是100%，有時因為實(shí)驗條件、試劑等原因擴(kuò)增效率還有可能大于100%。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算擴(kuò)增效率。PCR擴(kuò)增效率是10倍的(-1/slope)減1。*1' ‘ ‘ f f 丨 I ■(」]I 」’，‘'I ‘ f 廠 1" ‘ I j' ‘ I “‘ ■ J

2總RNA提取電泳圖（1-3:空白對照組；4-6:病毒感染組）. 12 Total RNA extracted from marrow (1-3: control; 4-6: PRRSV)檢測及測序cDNA為模板，分別擴(kuò)增ASAH1基因和p-actin基因，擴(kuò)，檢測結(jié)果如下圖。由圖可知，ASAH1基因擴(kuò)增特異性量Marker比較可知擴(kuò)增片段大小為140bp左右，與引物，擴(kuò)增特異性較好，無非特異擴(kuò)增，與分子量Marker比，與引物擴(kuò)增片段114bp吻合。圖13PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3596690