豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原,而且還與豬皮炎與腎炎綜合癥（PDNS）、豬先天性腦震顫（CT-AII）、增生性壞死性肺炎（PNP）等疾病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。該病毒感染豬體后能夠?qū)е聶C(jī)體免疫功能抑制,并且容易誘發(fā)雙重或多重感染,使病情復(fù)雜化,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PCV2含有兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame, ORF）,其中ORF2基因編碼的核衣殼（Cap）蛋白,是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)反應(yīng),并且PCV1與PCV2的Cap蛋白氨基酸的同源性比較低,兩者之間不存在血清交叉性反應(yīng)。因此Cap蛋白在血清學(xué)診斷及基因工程亞單位疫苗研究中具有重要意義。本研究分別利用原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）對(duì)PCV2 Cap蛋白進(jìn)行表達(dá),并對(duì)其進(jìn)行免疫原性分析。首先,進(jìn)行了PCV2 Cap蛋白在大腸桿菌——原核系統(tǒng)表達(dá)的研究。根據(jù)GenBank中公布的PCV2 WH株（FJ598044） ORF2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以PCV2 WH... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號(hào)列表
文獻(xiàn)綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒和血清
    1.2 酶類與主要試劑(盒)
    1.3 主要培養(yǎng)基與溶液的配置
    1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株
    1.5 主要儀器
    1.6 PCV2 WH株去信號(hào)肽ORF2基因的原核表達(dá)及其抗體的制備
        1.6.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        1.6.2 病毒DNA的提取及目的基因的獲得
        1.6.3 目的基因與表達(dá)載體的連接
        1.6.4 重組Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分析
        1.6.5 重組Cap蛋白的純化
        1.6.6 重組Cap蛋白的Western blotting鑒定
        1.6.7 重組Cap蛋白的濃度測(cè)定
        1.6.8 抗重組Cap蛋白血清的制備
        1.6.9 PCV2 WH株感染PK-15細(xì)胞的檢測(cè)
    1.7 PCV2 ORF2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)
        1.7.1 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        1.7.2 重組穿梭載體rBacmid-Cap2的構(gòu)建
        1.7.3 重組桿狀病毒的獲得與病毒擴(kuò)增
        1.7.4 重組Cap蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定
        1.7.5 病毒的滴度測(cè)定
        1.7.6 重組Cap蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
    1.8 重組Cap蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
        1.8.1 樣品的處理及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
        1.8.2 對(duì)免疫小鼠血清抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
        1.8.3 免疫小鼠血清抗體中和活性的分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 PCV2 WH株去信號(hào)肽ORF2基因的原核表達(dá)及其抗體的制備
        2.1.1 目的基因的擴(kuò)增
        2.1.2 表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-cap2的鑒定
        2.1.3 重組Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化
        2.1.4 重組Cap蛋白的濃度測(cè)定
        2.1.5 PCV2 WH株感染PK-15細(xì)胞的檢測(cè)
    2.2 PCV2 ORF2優(yōu)化基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)
        2.2.1 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac~(TM)HTA-cap2的鑒定
        2.2.2 重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid-cap2的鑒定
        2.2.3 重組桿狀病毒的獲得及鑒定
        2.2.4 Western blotting分析重組Cap蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)
        2.2.5 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
        2.2.6 病毒滴度的測(cè)定
        2.2.7 重組Cap蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
    2.3 重組Cap蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
        2.3.1 免疫小鼠血清抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)分析
        2.3.2 免疫小鼠血清中和效價(jià)的測(cè)定
3 討論
    3.1 PCV2 WH株ORF2基因的序列分析及其原核表達(dá)
    3.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的選擇
    3.3 核衣殼蛋白Cap在Sf9昆蟲(chóng)表達(dá)及影響其表達(dá)的因素
    3.4 重組Cap蛋白免疫小鼠試驗(yàn)
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 申世川,王一成,袁秀芳,徐麗華,李軍星.  浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2013(01)
[2]豬圓環(huán)病毒2型Rep和Rep’蛋白免疫原性及其抗體中和活性的測(cè)定[J]. 劉丹,王一平,危艷武,唐青海,吳洪麗,劉建波,李勝斌,魏萍,劉長(zhǎng)明.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2012(12)
[3]豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的分泌表達(dá)及其免疫原性研究[J]. 王霞,陳孝明,范紅結(jié),王貴平,李中圣.  畜牧與獸醫(yī). 2012(11)
[4]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)及鑒定[J]. 宋月,姜艷萍,崔文,李一經(jīng).  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2012(03)
[5]表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型SH1分離株Cap蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定[J]. 李文良,王先煒,馬濤,李玉峰,姜平.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2010(11)
[6]豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)[J]. 敬曉棋,吳發(fā)興,叢麗媛,張佩君,陳德坤.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(05)
[7]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白核定位信號(hào)區(qū)抗原表位的鑒定[J]. 郭龍軍,陸月華,黃立平,危艷武,劉長(zhǎng)明.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(07)
[8]豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)[J]. 郭春艷,葛俊偉,李一經(jīng).  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(06)
[9]豬圓環(huán)病毒2型核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫效果[J]. 王新,郭萬(wàn)柱,周婷,徐志文,王印,王小玉.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2008(08)
[10]Detection of PCV2 DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR[J]. HABIB Mudasser.  Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2007(03)

博士論文
[1]PCV-2 ORF2蛋白在桿狀病毒表面的展示及動(dòng)物免疫試驗(yàn)[D]. 邢福珊.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2011

碩士論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的研制及其PCV2抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 蘇相亭.揚(yáng)州大學(xué) 2013
[2]豬圓環(huán)病毒2a和2b亞型滅活疫苗及亞單位疫苗的交互免疫研究[D]. 付玉潔.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[3]桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗的研究[D]. 宋麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR診斷方法及基因芯片診斷方法的建立[D]. 葉芬.西南大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3591684