偽狂犬病毒是α-皰疹病毒屬成員,基因組由150kb左右的DNA雙鏈構(gòu)成。偽狂犬病毒感染豬只后會誘發(fā)宿主嚴重的傳染性疾病,給全世界生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。雖然長期以來偽狂犬病毒疫苗得到了廣泛應(yīng)用并很好地控制了該病的流行,但近年來偽狂犬病突然在我國經(jīng)過疫苗免疫的豬場爆發(fā)并在全國范圍內(nèi)流行,成為目前我國生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨的最大危害之一,這表明傳統(tǒng)疫苗失去了對偽狂犬病的免疫保護作用,更多研究報道也進一步說明該病毒的基因組或主要抗原基因已經(jīng)發(fā)生變異。傳統(tǒng)制備偽狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多個毒力基因,并經(jīng)過共幾十輪的低熔點瓊脂糖空斑純化,耗時耗力。因此亟需更高效經(jīng)濟的病毒疫苗制備策略來應(yīng)對變異毒株的爆發(fā)和流行等問題。本課題構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9和Cre/lox基因編輯系統(tǒng)的快速制備偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗的新方法,同步敲除偽狂犬病毒變異毒株P(guān)RV-HNX的TK和gE兩個毒力基因,成功制備了偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗侯選株,對當下流行的偽狂犬病有較好的免疫保護作用。主要步驟概括如下:1,利用CRISPR/Cas9和同源重組修復(fù)機制同時將綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表（Abbreviation）
第一章 文獻綜述
    1.1 偽狂犬病毒
        1.1.1 偽狂犬病毒的分子生物學(xué)及危害
        1.1.2 偽狂犬病毒疫苗
        1.1.3 目前偽狂犬病毒在我國流行趨勢
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR的發(fā)現(xiàn)和Cas家族的分型
        1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理和應(yīng)用
    1.3 Cre/lox重組系統(tǒng)的特性及應(yīng)用
第二章 研究目的及意義
第三章 材料和方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒和細胞
        3.1.2 實驗動物
        3.1.3 主要酶和試劑
        3.1.4 載體與質(zhì)粒
        3.1.5 培養(yǎng)基與抗生素及其制備
        3.1.6 主要緩沖液、試劑及其制備
        3.1.7 感受態(tài)細胞制備試劑
        3.1.8 低熔點瓊脂糖噬斑實驗試劑制備
    3.2 方法
        3.2.1 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)
        3.2.2 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測
        3.2.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.4 氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞
        3.2.5 轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物或質(zhì)粒載體
        3.2.6 質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定
            3.2.6.1 guide RNA的設(shè)計和表達載體構(gòu)建和鑒定
            3.2.6.2 體外擴增偽狂犬病毒gE和TK基因上下游同源臂
        3.2.7 堿裂解法小量抽提質(zhì)粒
        3.2.8 微量中和試驗（固定病毒-稀釋血清法）
        3.2.9 引物的設(shè)計合成
        3.2.10 PRN-HNX重組毒的鑒定
        3.2.11 細胞培養(yǎng)
        3.2.12 細胞PEI轉(zhuǎn)染
        3.2.13 低熔點瓊脂糖挑斑純化
        3.2.14 病毒的增殖、收獲和保存
        3.2.15 病毒基因組DNA提取
        3.2.16 測定病毒半數(shù)組織感染量（TCID50）
        3.2.17 小鼠動物實驗
        3.2.18 仔豬動物實驗
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定
        4.1.1 guide RNA的設(shè)計和表達載體構(gòu)建和鑒定
        4.1.2 TK、gE基因重組同源臂構(gòu)建
    4.2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建PRV-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重組毒
    4.3 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重組毒的純化
        4.3.1 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重組毒的單細胞流式分選純化
        4.3.2 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重組病毒的低熔點瓊脂糖噬斑純化
    4.4 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP重組病毒的鑒定
    4.5 利用Cre/lox系統(tǒng)敲除PRV-HNX-ΔTK-ΔgE-mCherry-GFP熒光基因
    4.6 PRV-HNX-ΔTK-ΔgE的純化和鑒定
    4.7 小鼠動物實驗
        4.7.1 小鼠攻毒實驗
        4.7.2 小鼠免疫實驗
    4.8 仔豬動物實驗
    4.9 討論
        4.9.1 sgRNA的設(shè)計
        4.9.2 同源重組片段的設(shè)計、擴增和融合
        4.9.3 細胞轉(zhuǎn)染和病毒感染條件的摸索
        4.9.4 偽狂犬病毒TK基因抑制劑BVDU的使用
        4.9.5 單細胞流式分選在重組病毒分選中的應(yīng)用
        4.9.6 CRISPR/Cas9編輯病毒基因組
        4.9.7 病毒傳染性疾病的防治和病毒的變異進化
        4.9.8 CRISPR/Cas9和Cre/lox基因編輯系統(tǒng)在疫苗制備中的潛力
        4.9.9 PRV基因缺失毒株的應(yīng)用
第五章 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]豬偽狂犬病疫苗的研究進展[J]. 楊毅,李文剛,饒寶,張永濤,呂玉金.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2010(03)
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[4]偽狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的構(gòu)建[J]. 顏其貴,郭萬柱,余光開,王琴,婁高明.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 1997(06)



本文編號：3591108