牛諾如病毒（BNoV）是國內(nèi)新發(fā)的犢牛腹瀉的病原,為建立高效快速、特異的BNoV定量檢測方法,本研究參照GenBank登錄的BNoV的RdRp基因的保守序列,設計合成了1對特異性引物和1條探針,通過優(yōu)化反應條件和體系,建立了BNoV的TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示,該方法選擇的引物具有高度特異性,只對BNoV有特異性擴增,而對牛冠狀病毒等4種犢牛腹瀉常見病原未見擴增;對BNoV核酸最低檢測限為15.9 copies/μL,且批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于2%,重復性好。對采集自2017年9月至2019年11月河南、山東和四川省的261份犢牛腹瀉樣本進行檢測,結(jié)果顯示BNoV的陽性檢出率為11.49%（30/261）。本研究建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法對BNoV的病原檢測和流行病學調(diào)查具有重要意義。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)科學. 2020,50(08)北大核心CSCD

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BNoV目的基因片段的PCR擴增Figure1PCRamplificationofthetargetfragmentofBNoV100bp

法檢出的所有陽性樣品。其中河南、四川省的樣本中BNoV檢出率分別為11.31％和25％，山東省的樣本中未檢出BNoV。3討論BNoV是犢牛腹瀉的主要病原之一，鑒于BNoV尚無成熟的分離培養(yǎng)體系，目前尚無有效的疫苗對其進行有效防疫。且BNoV與其他犢牛腹瀉病原如BCoV、BRoV和BVDV等混合感染時，會加重犢牛腹瀉病的程度［15］。因此，早期檢測和及時凈化病原是防控BNoV的重點。目前檢測BNoV的方法主要有電鏡觀察、抗原抗體ELISA檢測［16］、病毒分離、RT-PCR和實時熒光定量PCR等。觀察電鏡時需要較多的病毒粒子，且圖2熒光定量PCR方法的熔解曲線Figure2Meltingcurveofreal-timePCRforBNoV1：重組質(zhì)粒；2：陰性對照。1：pMD18T-BNoV-RdRp；2：Negativecontrol.760.241888.530572.819479.109385.398291.687197.977104.26610.555-83.155-d（Rn）/dT60626466687072747678808284868890溫度／℃Temperature12圖3熒光定量PCR方法的標準曲線Figure3Standardcurveofthereal-timePCR35.3232.7730.2227.8725.1222.5720.0217.4614.9112.36Ct1.02.03.04.05.06.07.08.09.0起始拷貝數(shù)的對數(shù)值logstartingquantity，copynumbery＝-3.19x+41.064，R2＝0.999圖4熒光定量PCR的特異性檢測Figure4Specificitytestofthereal-timePCR1：重組質(zhì)粒pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2～6：分別為BCoV、BRoV、BVDV、BAstV和ddH2O。1：pMD18T-BNoV-RdRp，1.59×106copies／L；2—6：BCoV，BRoV，BVDV，BAstVandddH2O，respectively.1.246601.087260.927920.768590.609250.449910.290570.13123-0.02810-0.18744Rn13579111315171921232527293

凳庇?舛?縋CR條件優(yōu)化及標準曲線的建立通過對引物濃度和探針濃度的優(yōu)化，最終確定熒光定量PCR反應體系：總體積為20L，其中2×Premix10L，BNoV-F/BNoV-R引物（10mol/L）各0.6L，BNoV-P探針（10mol/L）0.3L，模板2L，ddH2O6.5L。反應條件為：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號。將BNoV重組質(zhì)粒依次進行10倍倍比稀釋后，依照優(yōu)化后的反應體系及條件，對不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進行擴增。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在1.59×102copies／L～1.59×108copies／L之間線性關系良好（圖3），回歸方程為y＝－3.19x＋41.064，相關系數(shù)R2＝0.999。2.4熒光定量PCR的特異性分析利用本研究建立的熒光定量PCR方法分別對BCoV、BRoV、BVDV和BAstV的cDNA及重組質(zhì)粒pMD18T-BNoV-RdRp進行檢測。結(jié)果顯示，該方法僅對重組質(zhì)粒有擴增，其他病原及陰性對照均無特異性擴增（圖4）。2.5熒光定量PCR的敏感性分析將重組質(zhì)粒pMD18T-BNoV-RdRp進行10倍倍比稀釋后作為模板，利用優(yōu)化后的熒光定量PCR進行擴增。敏感性試驗結(jié)果顯示，該方法所能檢出的最低BNoV標準品拷貝數(shù)為15.9copies/L（圖5A），而常規(guī)PCR最低檢出BNoV的拷貝數(shù)為1.59×104copies/L（圖5B）。表明該熒光定量PCR方法敏感性更高。2.6熒光定量PCR的重復性分析以4個稀釋度的重組質(zhì)粒為模板分別進行批內(nèi)和批間重復性試驗。結(jié)果顯示，批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于2.0％（表2）。表明該方法具有良好的重復性。2.7臨床樣品的檢測兩種檢測方法對BNoV的檢出結(jié)果見表3。其中TaqMan熒光定量PCR方法檢出BNoV的樣品數(shù)為30份，BNoV陽性率為11.49％，且該方法檢出的陽性樣品包含RT-PCR方法檢出的所有陽性樣品。其中河南、四川省的樣本中BNoV檢出率分別


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