豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的以嚴(yán)重的腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為特征的豬的一種急性腸道傳染病，是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)主要疫病之一。1976年我國(guó)首次報(bào)道此病，2011年全國(guó)范圍內(nèi)再次爆發(fā)仔豬腹瀉疫情，新生仔豬的發(fā)病率和死亡率極高，為了探究此次仔豬腹瀉疫情的病因，了解病原的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，主要開展了以下研究：在仔豬腹瀉疫情流行期間，我們從浙江、福建等5個(gè)省、市不同地區(qū)的發(fā)病豬場(chǎng)采集了115份臨床腹瀉樣品，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示PEDV陽(yáng)性率高達(dá)81.7%，我們選取了部分陽(yáng)性樣品進(jìn)行PEDV全長(zhǎng)基因組和S、M、N、ORF3基因的克隆和測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳演化分析。全長(zhǎng)基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，流行毒株ZJCZ4與參考株CHGD-01的同源性較高，達(dá)到99.1%，與經(jīng)典代表株CV777的同源性為96.9%。主要結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明：流行毒株的S蛋白氨基酸發(fā)生變異較為明顯，變異位點(diǎn)主要集中在S1區(qū)域。與參考株CV777相比，流行毒株的S1中... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 病毒的發(fā)現(xiàn)
    1.2 病原學(xué)研究
        1.2.1 PEDV的分類地位
        1.2.2 PEDV的形態(tài)特征和理化性質(zhì)
        1.2.3 PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)特性
        1.2.4 PEDV的分子生物學(xué)特性
    1.3 病毒蛋白的研究
        1.3.1 S蛋白
        1.3.2 M蛋白
        1.3.3 N蛋白
        1.3.4 ORF3蛋白
    1.4 分子流行病學(xué)
        1.4.1 S基因
        1.4.2 M基因
        1.4.3 N基因
        1.4.4 ORF3基因
    1.5 實(shí)驗(yàn)室診斷方法
        1.5.1 RT-PCR方法
        1.5.2 免疫電鏡法
        1.5.3 ELISA法
        1.5.4 免疫熒光法
        1.5.5 微量血清中和試驗(yàn)
        1.5.6 原位雜交技術(shù)
    1.6 疫苗研究進(jìn)展
        1.6.1 滅活疫苗
        1.6.2 弱毒疫苗
        1.6.3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗
        1.6.4 乳酸桿菌疫苗
        1.6.5 亞單位疫苗
    1.7 研究目的與意義
第二章 豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析
    摘要
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 病料采集及處理
        2.1.3 引物設(shè)計(jì)
        2.1.4 臨床樣品檢測(cè)
        2.1.5 病毒基因的克隆及測(cè)序
        2.1.6 病毒基因組序列拼接分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 臨床腹瀉樣品RT-PCR檢測(cè)
        2.2.2 序列測(cè)定結(jié)果
        2.2.3 ZJCZ4Blast分析結(jié)果
        2.2.4 ZJCZ4全長(zhǎng)基因序列分析
        2.2.5 主要結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列比較
        2.2.6 ORF3基因分析
    2.3 討論
第三章 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立
    摘要
    3.1 材料與方法
        3.1.1 毒株與樣品來(lái)源
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物設(shè)計(jì)
        3.1.4 樣品中RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.1.5 鑒別診斷RT-PCR擴(kuò)增及最佳Tm值的確定
        3.1.6 RT-PCR最佳引物濃度的確定
        3.1.7 特異性試驗(yàn)
        3.1.8 敏感性試驗(yàn)
        3.1.9 RT-PCR檢測(cè)臨床樣品
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.2.2 RT-PCR特異性鑒定
        3.2.3 RT-PCR敏感性試驗(yàn)
        3.2.4 臨床樣品的檢測(cè)
    3.3 討論
第四章 豬流行性腹瀉病毒N蛋白抗原性分析及單克隆抗體的制備
    摘要
    4.1 材料與方法
        4.1.1 菌種、載體和血清
        4.1.2 主要試劑和耗材
        4.1.3 引物設(shè)計(jì)
        4.1.4 N基因的擴(kuò)增及克隆
        4.1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        4.1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定及純化
        4.1.7 N蛋白抗原性分析
        4.1.8 抗N蛋白單克隆抗體的制備
        4.1.9 多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定
        4.1.10 單克隆抗體的初步應(yīng)用
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 N基因的擴(kuò)增
        4.2.2 N基因重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        4.2.3 重組N蛋白的表達(dá)
        4.2.4 N蛋白的純化及westernblot分析
        4.2.5 間接ELISA方法的初步建立
        4.2.6 單克隆抗體的制備
        4.2.7 單克隆抗體的初步應(yīng)用
    4.3 討論
第五章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3575429