Gp96是熱休克蛋白HSP90家族一員,具有多種免疫學效應,包括提高抗原呈遞、刺激抗原呈遞細胞（APCs）產(chǎn)生細胞因子、激發(fā)機體特異性免疫應答及細胞毒性T細胞（CTL）反應,以及免疫佐劑效應。本論文主要研究豬Gp96N對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的B、T細胞表位合成肽疫苗、B細胞表位串聯(lián)亞單位疫苗以及豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）滅活疫苗的免疫佐劑效應。首先建立了表達豬Gp96N的大腸桿菌和畢赤酵母p.pastoris-X33表達系統(tǒng),利用純化的豬Gp96N作為免疫佐劑,在小鼠和豬上,從細胞免疫、體液免疫和天然免疫角度,分析了豬Gp96N對上述三種疫苗的免疫增強效應。研究結果為豬Gp96N作為免疫佐劑在疫苗中的應用提供了科學依據(jù)。從豬腎臟中提取RNA,采用RT-PCR擴增得到豬Gp96N基因cDNA片段,分別插入載體pET-32a和pPICZαA中,構建出原核表達載體pET-32a/Gp96N和真核表達載體pPICZaA/Gp96N,分別轉入大腸桿菌BL21和畢赤酵母p.pastoris-X33中,經(jīng)抗性篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET-32a/Gp96N和重組畢赤酵母p.p... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

大腸表達豬Gp96N的基因克隆（A)、SDS-PAGE(B)和Westerblot檢測結果（C)

3.2.1 PCR擴増得到豬Gp96N基因以pET-32a/Gp96N為模板，經(jīng)PCR擴增得到1002bp左右的片段（圖2-2)，與預期相符，表明PCR擴增得到豬Gp%N基M(bp) 130(%■靈免,交■？f^r?- ^圖2-2酵母菌表達豬Gp96N的基因克隆Fig.2-2 PCR product of Gp96N gene. M: DNA marker ； 1 :Gp96N gene3.2.2構建得到畢赤酵姆表達質粒pPICZaA/Gp96N將PCR擴增得到的豬Gp%N基閃片段勾載體pPICZaA用A7;o /和Xk//雙酶切，純化冋收酶切產(chǎn)物，WT4DNA連接酶反應1211構建重組表達質粒pPICZaA-Gp96N，轉化人腸桿歯DH5a感受態(tài)細胞，獲得重組歯。挑取重組歯單克隆，提取質粒，表達質粒pPICZaA-Gp%N經(jīng)/和/雙酶切后，電泳檢測結果如圖2-3所示

.15統(tǒng)計學分析釆用r檢驗法比較各組之W的差異，/^>0.05代表差兄顯著；*尸<0.05代表差兄顯著；**尸<0.01表差兄非常顯著；***P<0.001代表差兄極顯著。結果與分析.1 PRRSV的B細胞表位和T細胞表位的序列分析選樣2條文獻報道的能被PRRSV中和抗體識別的B細胞表位Gp4-59B和Gp5-37B，以及7條RRSV的T細胞抗原表位（表3-1)。然后，從GeneBank t下載了大量II哨PRRSV毒株的GP4(379）、GP5 (1001條）和N蛋(226條）序列，利用Weblogo軟件對這些表位的氨基酸進行保守性析，結果如圖3-1所示，除GP4-59B變兄性較大外，其他8條序列（GP5-37B、GP4-7T、GP4-170T、P5-149T、GP5-U7T、N-49T、N-63T和N-104T)均丨?分保守。利用DNAStar軟件分析表位的抗原發(fā)現(xiàn)GP5-37B、GP4-7T和GP4-170T的抗原性較差，其他6條表位的抗原性均較商（圖3-1)。因，報據(jù)保守性分析結果合成這些表位多肽。S % e T I N k I s (;p4-l70'^;< ■ ? * ? i ? t r i

【參考文獻】：
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碩士論文
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本文編號：3564126