蜱是一類(lèi)重要的吸血體外寄生蟲(chóng),絕大多數(shù)寄生在哺乳動(dòng)物體表,少數(shù)寄生在鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)及兩棲類(lèi),蜱不但吸食大量血液,損害宿主皮膚,而且可以在叮咬過(guò)程中傳播多種病原體,是人和動(dòng)物許多重要疾病的傳播媒介。在蜱的吸血過(guò)程當(dāng)中,唾液腺是病原體傳播給宿主的通道,是蜱及蜱傳病防治中關(guān)鍵的靶器官。雌蜱的唾液腺在蜱吸血末期和飽血后會(huì)發(fā)生快速的退化,這一現(xiàn)象主要是由唾液腺細(xì)胞凋亡等程序化細(xì)胞死亡機(jī)制引起的。本論文選擇唾液腺中發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制分子（Inhibitor of Apoptosis Protein,IAP）,探索其在蜱唾液腺細(xì)胞凋亡的作用,并通過(guò)RNA干擾技術(shù)研究其功能和應(yīng)用潛力。研究對(duì)象為鐮形扇頭蜱,一種大量分布于我國(guó)南部的優(yōu)勢(shì)蜱種,屬于硬蜱家族,為三宿主蜱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期唾液腺轉(zhuǎn)錄組庫(kù)的數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)引物,成功從半飽血成蜱唾液腺中擴(kuò)增出鐮形扇頭蜱凋亡抑制分子（Rhipicephalus heamaphysaloides IAP,RhIAP）的基因編碼序列,大小1887 bp,編碼607個(gè)氨基酸,RhIAP的蛋白大小約66 kDa,有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域。經(jīng)由實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了Rh... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

RhIAP擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果

IAP的BIR1（第53-122氨基酸）和BIR2（第198-263氨基酸）分別含有70和66個(gè)氨基酸，它們之間相隔75個(gè)氨基酸，BIR3（第330-398氨基酸）包含69個(gè)氨基酸，與BIR2相隔66個(gè)氨基酸，接下來(lái)相隔155個(gè)氨基酸后是含有個(gè)氨基酸的RING值結(jié)構(gòu)域（第554-607氨基酸）。圖2-2測(cè)序后的RhIAP的全長(zhǎng)基因序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列綠色，藍(lán)色，黃色和紅色網(wǎng)格分別是BIR1，BIR2，BIR3和RING指結(jié)構(gòu)域。Fig.2-2.NucleotideandpredictedaminoacidsequencesofRhIAPTheBIR1,BIR2,BIR3andRINGfingerdomainsaresignedbygreen,blue,yellowandredgrid.圖2-3測(cè)序后RhIAP核苷酸序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域Fig.2-3TheconserveddomainanylisisresultofRhIAPsequencebyNCBI102030405060708090100110120130140150TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGCCTGGAGCCTACGCAGTTGTGAAACAGGAGGAATACCAGGAGGTGCGCCTTGGTTGCGTTAGGTTTCCCAAGTTGAATTTCGTTGCTGTTCACTCGGCTCCGCTGTTTCGTCT160170180190200210220230240250260270280290300GGACAGGATCGGCCTGTGTGGGGCCAGTCATCACGCAGAGAGGCGTGTACGATGGATAAGCCTAGAGCCAATGCGAGTGGTACAGGAAATCAGCGTGCTTTATCAATGACGCGGCGGTAAAATGAAATTTCCTGATAACCATTCACTGCT310320330340350360370380390400410420430440450CAGTTCGGCGTCCCGACTGCCGCACATCGAGCCTGTTGATGTGTTCAATGGCGTCTATGATGGTGGGCACGGCAGTGACGCAACGGGGGCCGCTCGCCTTCCCGGCATCTGAGCAGACGGTTCTGGATGGGTCCATGGGGGCAGTGGTGAMCSMASMMVGTAVTQRGPLAFPASEQTVLDGSMGAVVS460470480490500510520530540550560570580590600GCAAGTTCACCAAGATGGCCGGTACTGCTGACTATAGCCGAGAGGAACACAGGCTTCCCACTTTTAGTGAGTGGCCCCCAAACGCCCCAGTATCTGCGAAAAAGCTGGCCCAGGGTGGCTTTGTGTGTATTAACGCTTCCAGACTTCTGAKFTKMAGTADYSREEHRLPTFSEWPPNAPVSAKKLAQGGFV

sapiens，sp|P98170|；Ixodesscapularis，tr|B7Q7F6|；Ixodesricinus，tr|A0A147BHH1|；Bombyxmori，tr|E9JEI0|；Aedesaegypti，tr|Q175J8|；Drosophilamelanogaster，sp|Q24307|；Rhipicephalusappendiculatus，tr|A0A131YI84|。利用MEGA5，通過(guò)最大概似法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示鐮形扇頭蜱RhIAP與具尾扇頭蜱關(guān)系最近，同源性高達(dá)87.81%，其次是兩種硬蜱，肩突硬蜱54.07%，篦子硬蜱48.19%，接下來(lái)是三種節(jié)肢動(dòng)物，果蠅32.64%，伊蚊32.21%，蠶31.61%，與哺乳動(dòng)物同源性較低，家鼠28.67%，小鼠28.2%，人27.21%。圖2-4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建Fig.2-4.phylogenetictreeofRhIAPfromdifferentorganismsbasedonaminoacidsequence2.5討論凋亡抑制蛋白家族成員眾多，分布廣泛，從結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的原生動(dòng)物到復(fù)雜的多細(xì)胞生物體，從有脊椎的哺乳動(dòng)物到無(wú)脊椎的節(jié)肢動(dòng)物都有IAP蛋白，而對(duì)于蜱尚未有關(guān)于凋亡抑制分子的研究。本研究選擇在鐮形扇頭蜱唾液腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一條凋亡抑制相關(guān)基因，根據(jù)其ORF設(shè)計(jì)引物，克隆獲得了鐮形扇頭蜱的凋亡抑制蛋白基因序列，命名為RhIAP。獲得的RhIAP是一個(gè)典型的有桿狀病毒IAP重復(fù)序列的凋亡抑制分子，在C末端還有一個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域。根據(jù)序列同源性，IAP分子分為IAP1至IAP5五種類(lèi)型(LUQUEetal.2001)，RhIAP與果蠅的DIAP2，其他物種的IAP2以及哺乳動(dòng)物XIAP有相同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，都有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域，因此判斷RhIAP也屬于2型IAP分子。凋亡抑制分子主要分布在細(xì)胞核附近，所以一般不含有信號(hào)肽序列，通過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)RhIAP也不含有信號(hào)肽序列。將RhIAP與其他幾種硬蜱、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的2型IAP進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示RhIAP與其他硬蜱家族IAP2氨基酸序列的同源性并不算高，除了與具尾扇頭蜱處在同一分支


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