蜱是一類重要的吸血體外寄生蟲,絕大多數(shù)寄生在哺乳動物體表,少數(shù)寄生在鳥類、爬行類及兩棲類,蜱不但吸食大量血液,損害宿主皮膚,而且可以在叮咬過程中傳播多種病原體,是人和動物許多重要疾病的傳播媒介。在蜱的吸血過程當中,唾液腺是病原體傳播給宿主的通道,是蜱及蜱傳病防治中關鍵的靶器官。雌蜱的唾液腺在蜱吸血末期和飽血后會發(fā)生快速的退化,這一現(xiàn)象主要是由唾液腺細胞凋亡等程序化細胞死亡機制引起的。本論文選擇唾液腺中發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制分子（Inhibitor of Apoptosis Protein,IAP）,探索其在蜱唾液腺細胞凋亡的作用,并通過RNA干擾技術研究其功能和應用潛力。研究對象為鐮形扇頭蜱,一種大量分布于我國南部的優(yōu)勢蜱種,屬于硬蜱家族,為三宿主蜱。根據實驗室前期唾液腺轉錄組庫的數(shù)據,設計引物,成功從半飽血成蜱唾液腺中擴增出鐮形扇頭蜱凋亡抑制分子（Rhipicephalus heamaphysaloides IAP,RhIAP）的基因編碼序列,大小1887 bp,編碼607個氨基酸,RhIAP的蛋白大小約66 kDa,有3個BIR結構域和一個RING指結構域。經由實時定量PCR方法檢測了Rh... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

RhIAP擴增凝膠電泳結果

IAP的BIR1（第53-122氨基酸）和BIR2（第198-263氨基酸）分別含有70和66個氨基酸，它們之間相隔75個氨基酸，BIR3（第330-398氨基酸）包含69個氨基酸，與BIR2相隔66個氨基酸，接下來相隔155個氨基酸后是含有個氨基酸的RING值結構域（第554-607氨基酸）。圖2-2測序后的RhIAP的全長基因序列及預測的氨基酸序列綠色，藍色，黃色和紅色網格分別是BIR1，BIR2，BIR3和RING指結構域。Fig.2-2.NucleotideandpredictedaminoacidsequencesofRhIAPTheBIR1,BIR2,BIR3andRINGfingerdomainsaresignedbygreen,blue,yellowandredgrid.圖2-3測序后RhIAP核苷酸序列經NCBI網站預測結構域Fig.2-3TheconserveddomainanylisisresultofRhIAPsequencebyNCBI102030405060708090100110120130140150TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGCCTGGAGCCTACGCAGTTGTGAAACAGGAGGAATACCAGGAGGTGCGCCTTGGTTGCGTTAGGTTTCCCAAGTTGAATTTCGTTGCTGTTCACTCGGCTCCGCTGTTTCGTCT160170180190200210220230240250260270280290300GGACAGGATCGGCCTGTGTGGGGCCAGTCATCACGCAGAGAGGCGTGTACGATGGATAAGCCTAGAGCCAATGCGAGTGGTACAGGAAATCAGCGTGCTTTATCAATGACGCGGCGGTAAAATGAAATTTCCTGATAACCATTCACTGCT310320330340350360370380390400410420430440450CAGTTCGGCGTCCCGACTGCCGCACATCGAGCCTGTTGATGTGTTCAATGGCGTCTATGATGGTGGGCACGGCAGTGACGCAACGGGGGCCGCTCGCCTTCCCGGCATCTGAGCAGACGGTTCTGGATGGGTCCATGGGGGCAGTGGTGAMCSMASMMVGTAVTQRGPLAFPASEQTVLDGSMGAVVS460470480490500510520530540550560570580590600GCAAGTTCACCAAGATGGCCGGTACTGCTGACTATAGCCGAGAGGAACACAGGCTTCCCACTTTTAGTGAGTGGCCCCCAAACGCCCCAGTATCTGCGAAAAAGCTGGCCCAGGGTGGCTTTGTGTGTATTAACGCTTCCAGACTTCTGAKFTKMAGTADYSREEHRLPTFSEWPPNAPVSAKKLAQGGFV

sapiens，sp|P98170|；Ixodesscapularis，tr|B7Q7F6|；Ixodesricinus，tr|A0A147BHH1|；Bombyxmori，tr|E9JEI0|；Aedesaegypti，tr|Q175J8|；Drosophilamelanogaster，sp|Q24307|；Rhipicephalusappendiculatus，tr|A0A131YI84|。利用MEGA5，通過最大概似法構建進化樹，結果顯示鐮形扇頭蜱RhIAP與具尾扇頭蜱關系最近，同源性高達87.81%，其次是兩種硬蜱，肩突硬蜱54.07%，篦子硬蜱48.19%，接下來是三種節(jié)肢動物，果蠅32.64%，伊蚊32.21%，蠶31.61%，與哺乳動物同源性較低，家鼠28.67%，小鼠28.2%，人27.21%。圖2-4系統(tǒng)進化樹的構建Fig.2-4.phylogenetictreeofRhIAPfromdifferentorganismsbasedonaminoacidsequence2.5討論凋亡抑制蛋白家族成員眾多，分布廣泛，從結構簡單的原生動物到復雜的多細胞生物體，從有脊椎的哺乳動物到無脊椎的節(jié)肢動物都有IAP蛋白，而對于蜱尚未有關于凋亡抑制分子的研究。本研究選擇在鐮形扇頭蜱唾液腺轉錄組文庫中發(fā)現(xiàn)的一條凋亡抑制相關基因，根據其ORF設計引物，克隆獲得了鐮形扇頭蜱的凋亡抑制蛋白基因序列，命名為RhIAP。獲得的RhIAP是一個典型的有桿狀病毒IAP重復序列的凋亡抑制分子，在C末端還有一個RING指結構域。根據序列同源性，IAP分子分為IAP1至IAP5五種類型(LUQUEetal.2001)，RhIAP與果蠅的DIAP2，其他物種的IAP2以及哺乳動物XIAP有相同的結構域構成，都有3個BIR結構域和一個RING指結構域，因此判斷RhIAP也屬于2型IAP分子。凋亡抑制分子主要分布在細胞核附近，所以一般不含有信號肽序列，通過軟件分析發(fā)現(xiàn)RhIAP也不含有信號肽序列。將RhIAP與其他幾種硬蜱、昆蟲和哺乳動物的2型IAP進行同源性分析，結果顯示RhIAP與其他硬蜱家族IAP2氨基酸序列的同源性并不算高，除了與具尾扇頭蜱處在同一分支


本文編號：3544569