T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物,是這類毒素中毒性最強的一種,是污染飼料的主要的霉菌毒素,對人、畜禽健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的危害。急性暴露單端孢毒素可導(dǎo)致嘔吐和腹瀉,長期暴露可致機體厭食,抑制生長,造成內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等損傷嚴重。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),T-2毒素的靶器官之一是動物的腦垂體,實驗室前期研究表明,T-2毒素可以抑制大鼠垂體瘤GH3細胞生長激素的分泌,生長激素對于脊椎動物的生長調(diào)控起重要作用。目前,T-2毒素對動物生長抑制機制的研究并不深入,其影響生長激素的合成和分泌機制并未得到很好的揭示�，F(xiàn)今,基因組和蛋白組學(xué)技術(shù)已成為研究毒理作用機理和尋找靶點的新手段。鑒于T-2毒素抑制生長毒性的重要性,本研究選擇中低劑量(10nM和40nM)的T-2毒素暴露大鼠垂體瘤GH3細胞為實驗材料,運用安捷倫大鼠44K基因芯片和雙向電泳-質(zhì)譜鑒定技術(shù)相結(jié)合,篩選T-2毒素作用于GH3細胞后的差異基因和差異蛋白,分析與抑制生長毒性作用相關(guān)的基因、蛋白及抑制生長激素合成與分泌的分子機制。為今后國內(nèi)外T-2毒素的研究提供參考,進而為食品安全和控制靶點提供科學(xué)依據(jù)。 1.毒素的選擇和毒素作用時間和濃度...

【文章來源】： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 立題依據(jù)
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢
        1.2.1 T-2毒素的化學(xué)組成及危害
        1.2.2 單端孢毒素抑制生長的機理
        1.2.3 T-2毒素毒性機制的研究方法
    1.3 目的意義
2 材料與方法
    2.1 細胞株
    2.2 主要試劑
    2.3 主要儀器設(shè)備
    2.4 主要溶液的配制
    2.5 細胞培養(yǎng)及凍存
    2.6 MTT篩選對GH3細胞毒性最大的單端孢毒素
    2.7 毒素作用合適濃度和時間測定(ELISA方法檢測生長激素濃度)
        2.7.1 待測樣本準備
        2.7.2 操作步驟
    2.8 毒素作用差異基因的檢測(基因芯片)
        2.8.1 樣品RNA的抽提(TRIZOL法)
        2.8.2 cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成
        2.8.3 熒光標記cRNA合成
        2.8.4 熒光探針純化
        2.8.5 芯片雜交
        2.8.6 芯片洗滌
        2.8.7 芯片掃描及數(shù)據(jù)分析
        2.8.8 部分差異基因驗證(Real-Time PCR)
    2.9 GH3細胞蛋白質(zhì)二維電泳條件優(yōu)化及質(zhì)譜鑒定
        2.9.1 細胞處理及分組
        2.9.2 GH3細胞蛋白提取方法
        2.9.3 蛋白質(zhì)定量
        2.9.4 二維凝膠電泳
        2.9.5 圖像掃描及分析
        2.9.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定
        2.9.7 Western Blot方法驗證GH和GRP78蛋白表達情況
3 結(jié)果與分析
    3.1 T-2毒素作用于GH3細胞的毒性最大
    3.2 T-2毒素作用合適濃度和時間確定
        3.2.1 細胞生存活力的檢測
        3.2.2 T-2毒素對GH3細胞GH分泌的影響
    3.3 T-2作用差異基因的分析(基因芯片)
        3.3.1 總RNA質(zhì)量
        3.3.2 芯片質(zhì)量與結(jié)果可靠性分析
        3.3.3 毒素作用后差異表達基因
        3.3.4 關(guān)鍵基因mRNA表達水平的驗證
    3.4 T-2毒素作用GH3細胞的差異蛋白分析(雙向電泳-質(zhì)譜)
        3.4.1 雙向電泳條件的優(yōu)化
        3.4.2 T-2處理GH3細胞的2D圖譜
        3.4.3 T-2處理GH3細胞2D圖譜分析
        3.4.4 差異蛋白點的鑒定分析
        3.4.5 Western Blot驗證GH和BIP蛋白
    3.5 基因芯片結(jié)果與蛋白組的比對
4 討論
    4.1 T-2毒素作用GH3細胞濃度和時間的確定
    4.2 T-2毒素對GH3細胞GH合成分泌的影響
        4.2.1 生長激素合成的相關(guān)基因和蛋白
        4.2.2 生長激素加工相關(guān)的基因與蛋白
        4.2.3 間接影響GH合成加工的基因與蛋白
        4.2.4 生長激素分泌相關(guān)基因與蛋白
        4.2.5 能量代謝相關(guān)基因與蛋白
    4.3 T-2毒素作用于GH3細胞的時間關(guān)系
    4.4 基因芯片與蛋白組學(xué)結(jié)果之間的關(guān)系
5 全文總結(jié)
文獻綜述
    1 毒理基因組學(xué)
        1.1 毒理基因組學(xué)的產(chǎn)生及其基本概念
        1.2 毒理基因組學(xué)的主要技術(shù)
        1.3 毒理基因組的應(yīng)用
            1.3.1 毒性作用機制的研究
            1.3.2 毒作用的量效關(guān)系和實效關(guān)系的研究
            1.3.3 篩選生物標志物
            1.3.4 動物毒性的實驗結(jié)果的外推
        1.4 毒理基因組面臨的問題挑戰(zhàn)
        1.5 毒理基因組的發(fā)展趨勢
    2 毒理蛋白組學(xué)
        2.1 毒理蛋白質(zhì)組學(xué)的概念和相關(guān)背景
        2.2 毒理蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)平臺
        2.3 毒理蛋白組學(xué)的應(yīng)用
            2.3.1 研究外源性物質(zhì)對生命有機體的毒性機制
            2.3.2 篩選化合物毒性評價的生物標志物
        2.4 毒理蛋白組學(xué)的發(fā)展趨勢與展望
參考文獻
致謝
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]基因芯片技術(shù)研究Z24對人HepG2細胞基因表達的影響 [J]. 王全軍,吳純啟,余壽忠,廖明陽.  中國新藥雜志. 2004(02)



本文編號：3543322