發(fā)布時間：2021-12-17 13:31

　　旨在構(gòu)建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15細(xì)胞系PK-15-TPL2^-/-,評估該基因敲除前后對口蹄疫病毒（FMDV）和塞內(nèi)卡病毒（SVA）復(fù)制的影響及產(chǎn)生影響的原因,為研究TPL2在病毒感染過程中的作用機制提供良好的生物材料,也為疫苗生產(chǎn)過程中進一步提升FMDV和SVA產(chǎn)量指明方向。篩選2條針對TPL2基因的單向?qū)NA（sg RNA）,合成sg RNA并將其插入到含有GFP標(biāo)簽的慢病毒表達(dá)載體,構(gòu)建sg RNA/Cas9慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,包裝慢病毒并感染PK-15細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀分選出已被轉(zhuǎn)入sg RNA的單細(xì)胞。通過測序確認(rèn)細(xì)胞系中TPL2的DNA序列,通過蛋白質(zhì)印跡（Western blot）方法檢測細(xì)胞系中TPL2表達(dá)情況。使用FMDV和SVA感染構(gòu)建好的細(xì)胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀評估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-細(xì)胞中的復(fù)制水平,在此基礎(chǔ)上通過測定干擾素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表達(dá)水平,研究了FMDV或SVA... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2020,51(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：14 頁

【部分圖文】：

敲除TPL2基因的PK-15細(xì)胞系的建立

敲除TPL2顯著增加FMDV和SVA復(fù)制,為了研究TPL2敲除促進FMDV和SVA復(fù)制的可能原因,利用RT-qPCR檢測感染FMDV和SVA后不同時間PK-15細(xì)胞及PK-15-TPL2-/-細(xì)胞內(nèi)干擾素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表達(dá)水平。如圖6所示,FMDV和SVA感染引起PK-15細(xì)胞內(nèi)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA表達(dá)上調(diào),這提示FMDV和SVA感染能夠激活I(lǐng)FN信號。然而在FMDV和SVA感染的PK-15-TPL2-/-細(xì)胞內(nèi)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56 mRNA的表達(dá)明顯降低,并且與時間不存在良好的相關(guān)性。這表明FMDV和SVA感染期間激活了干擾素信號通路,敲除TPL2能夠抑制干擾素信號通路導(dǎo)致IFN-α、IFN-β和IFN-γ表達(dá)下調(diào),同時抑制干擾素刺激基因ISG15、ISG54和ISG56的產(chǎn)生進而促進病毒的復(fù)制,在這個過程中是否還有其他因素參與,還有待進一步研究。3 討 論

自19世紀(jì)80年代細(xì)菌限制性內(nèi)切酶首次應(yīng)用于DNA重組以來,基因編輯技術(shù)已有近40年歷史[27-28]。但由于技術(shù)上的不成熟,在當(dāng)時并沒有被廣泛應(yīng)用。直到開發(fā)出操作方便、基因編輯功能精確并具有高性價比的工程核酸酶,該領(lǐng)域才取得重大進展[29]。目前ZNF、TALEN和CRISPR/Cas9三種基因編輯核酸內(nèi)切酶已經(jīng)應(yīng)用于臨床。其中,CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其高效、快速、多功能、易用、低成本等優(yōu)點,成為該領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù),并已應(yīng)用在各物種中[30]。本研究利用該技術(shù)成功構(gòu)建了敲除TPL2基因的PK-15細(xì)胞系,Western blot分析表明,建立的細(xì)胞系中TPL2蛋白已完全敲除。隨機選取1號細(xì)胞株進行功能評價,并將該細(xì)胞系命名為PK-15-TPL2-/-。圖4 TPL2基因敲除促進SVA在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制


本文編號：3540222