單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一種革蘭氏陽性胞內(nèi)菌。該菌含有溶血素O（Listeriolysin O,LLO）,可引起宿主細胞膜結構穿孔,對于單增李斯特菌在細胞內(nèi)復制至關重要。前期有研究發(fā)現(xiàn),單增李斯特菌感染宿主細胞后,LLO能引起絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族蛋白ERK1/2磷酸化,但機制未知。本研究以單增李斯特菌感染Caco-2細胞為模型解析ERK1/2被磷酸化的分子機制。我們分別利用單增李斯特菌和純化的重組LLO蛋白（5n M）感染或處理Caco-2細胞,檢測ERK1/2的表達及磷酸化水平變化。我們發(fā)現(xiàn),單增李斯特菌感染Caco-2細胞后能顯著增加ERK1/2的磷酸化水平,并在感染或處理半個小時后達到高峰且呈LLO依賴性。該ERK1/2的磷酸化水平與細胞內(nèi)LLO的濃度呈正相關,當用膽固醇封閉LLO對宿主細胞的膜結合位點后,LLO喪失啟動ERK1/2磷酸化的能力。我們也發(fā)現(xiàn),LLO缺失活性位點PEST序列并不影響其激活ERK1/2磷酸化,這說明LLO啟動ERK1/2的磷酸化與LLO與宿主細胞的膜結合位點有關而與活性位點無關。進一步... 

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學浙江省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

單增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回補突變體（B）在所示時間點感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表達情況

試驗研究152.2重組蛋白LLO處理Caco-2細胞活化ERK1/2蛋白分析Caco-2細胞與5nM濃度的LLO一起孵育，如圖1.2A所示，孵育5分鐘便顯示出明顯的ERK1/2磷酸化的活化，這種情況在一小時后逐漸消失，我們推測這種情況與LLO胞內(nèi)降解有關。我們還發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化的激活作用呈LLO濃度依賴性，0.5nM的非常低的濃度足以激活ERK1/2磷酸化，ERK1/2磷酸化蛋白也隨著LLO濃度的遞增而逐漸增多，見圖1.2B。圖1.1.單增李斯特菌野生型菌株EGD-e（A）或hly缺失和回補突變體（B）在所示時間點感染Caco-2激活MAPK的磷酸化ERK1/2蛋白表達情況。*P<0.05;**P<0.01;ns，無顯著差異。Figure1.1.ExpressionofMAPkinasesERK1andERK2inhumanepithelialcellsCaco-2infectedwithLMwild-typeEGD-e(A)orthehlydeletionandcomplementedmutants(B)fortheindicatedtimepoints.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.圖1.2.純化的重組LLO蛋白在不同時間點（A）和不同濃度（B）處理Caco-2細胞激活磷酸化ERK1/2蛋白表達情況。*P<0.05;**P<0.01;ns，無顯著差異。Figure1.2.ExpressionofERK1/2inCaco-2cellstreatedwiththepurifiedrecombinantLLOatdifferenttimepoints(A)withvariousconcentrationsofprotein(B).P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.

試驗研究252試驗結果2.1PEST序列不影響LLO激活ERK1/2磷酸化用1％TritonX-100孵育的紅細胞確定最大（100％）溶血活性，用PBS孵育的紅細胞確定最小（0％）溶血活性。純化的LLO或其變蛋白LLOΔPEST在各種濃度（0-35nM）下的溶血情況見圖2.1A，PEST序列在一定濃度下不影響LLO的溶血活性。并且，當我們使用LLO能引起細胞發(fā)生磷酸化的孵育濃度5nM時，PEST序列在LLO誘導Caco-2細胞中的ERK1/2蛋白磷酸化中并未起到關鍵作用，詳見圖2.1B。2.2LLO對細胞膜的裂解能力與其含量成正比鑒于LLO最主要的功能是錨定富含膽固醇的細胞膜，并進行打孔，這里利用碘化丙碇檢測了LLO不同濃度下對細胞的膜的破壞情況，見圖2.2。LLO在低至0.5nM的濃度下基本無法直觀觀察到其對細胞膜的作用，但隨著LLO蛋白圖2.1.PEST序列對LLO激活ERK1/2磷酸化的影響。（A）純化的LLO或其變體LLOΔPEST在各種濃度（0-35nM）下的溶血活性。用1%TritonX-100或PBS孵育的紅細胞分別用于確定最大（100％）和最�。�0％）溶血活性。（B）LLOPEST樣序列在Caco-2細胞中誘導的ERK1/2磷酸化的作用及灰度分析。*P<0.05;**P<0.01;ns，無顯著差異。Figure2.1.TheinfluenceofPESTsequenceonLLOactivationofERK1/2phosphorylation.(A)HemolyticactivityofthepurifiedLLOoritsvariantLLOΔPESTatvariousconcentrations(0-35nM).Erythrocytesincubatedwith1%TritonX-100orPBSservedtodeterminethemaximum(100%)andminimum(0%)hemolyticactivity,respectively.(B)RolesofthePEST-likesequenceinLLO-inducedERK1/2phosphorylationinCaco-2cells.P<0.05;P<0.01;nsmeansnosignificance.


本文編號：3524344