為了探究維氏氣單胞菌毒力因子脂蛋白的致病機制,在全基因測序的基礎上,通過同源重組缺失脂蛋白基因。首先擴增脂蛋白基因的上下游同源臂,通過重疊PCR連接后,凝膠回收DNA片段;連接克隆載體pMD18-T,轉化DH5α感受態(tài)細胞,測序成功后提取質粒進行雙酶切,連入相同酶切的Pre112自殺性質粒;依次轉化DH5α-λpir、WM3064感受態(tài)細胞,作為供體菌;和受體菌野生株進行同源重組,并篩選鑒定。結果顯示,成功缺失了維氏氣單胞菌脂蛋白基因。生物學特性分析結果發(fā)現(xiàn),缺失株和野生株的生長速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游動能力減弱,細菌的毒力降低,溶血活性沒有明顯變化。因此,成功構建了維氏氣單胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物學特性,為進一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基礎。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)科學. 2020,50(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

上下游同源臂的擴增連接與重組質粒的酶切鑒定

取結合轉移中第2次同源重組的菌液提取基因組，用引物L-1-F和L-2-R驗證，在996 bp處可見特異性條帶（見圖2A），表明缺失株構建成功。對缺失成功的菌株進行c DNA驗證，首先對提取的RNA進行質量和完整性檢測，有3條清晰條帶，RNA完整（見圖2B）。反轉錄得到c DNA后作為模板進行PCR驗證，只有WT有238 bp的條帶，其他沒有條帶（見圖2C），證明已成功構建了脂蛋白Lpp缺失株ΔLpp。對驗證成功的ΔLpp進行遺傳穩(wěn)定性的檢測，取缺失株傳代第43～50次的菌液進行PCR驗證，在996 bp處均有條帶，表明遺傳穩(wěn)定（見圖2D）。2.2 脂蛋白Lpp基因的表達情況

以16S r RNA為內參基因進行實時熒光定量PCR檢測，WT作為對照，結果未檢測到缺失株中Lpp基因的表達（見圖3）。2.3 缺失株ΔLpp的生物學特性分析

【參考文獻】：
期刊論文
[1]維氏氣單胞菌rpoN基因缺失株的構建及部分生物學特性分析[J]. 蔡金雙,王冬雪,單曉楓,康元環(huán),張冬星,田佳鑫.  中國獸醫(yī)科學. 2020(06)



本文編號：3522362