為了探究維氏氣單胞菌毒力因子脂蛋白的致病機(jī)制,在全基因測(cè)序的基礎(chǔ)上,通過(guò)同源重組缺失脂蛋白基因。首先擴(kuò)增脂蛋白基因的上下游同源臂,通過(guò)重疊PCR連接后,凝膠回收DNA片段;連接克隆載體pMD18-T,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,測(cè)序成功后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,連入相同酶切的Pre112自殺性質(zhì)粒;依次轉(zhuǎn)化DH5α-λpir、WM3064感受態(tài)細(xì)胞,作為供體菌;和受體菌野生株進(jìn)行同源重組,并篩選鑒定。結(jié)果顯示,成功缺失了維氏氣單胞菌脂蛋白基因。生物學(xué)特性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺失株和野生株的生長(zhǎng)速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游動(dòng)能力減弱,細(xì)菌的毒力降低,溶血活性沒(méi)有明顯變化。因此,成功構(gòu)建了維氏氣單胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物學(xué)特性,為進(jìn)一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(11)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

上下游同源臂的擴(kuò)增連接與重組質(zhì)粒的酶切鑒定

取結(jié)合轉(zhuǎn)移中第2次同源重組的菌液提取基因組，用引物L(fēng)-1-F和L-2-R驗(yàn)證，在996 bp處可見(jiàn)特異性條帶（見(jiàn)圖2A），表明缺失株構(gòu)建成功。對(duì)缺失成功的菌株進(jìn)行c DNA驗(yàn)證，首先對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量和完整性檢測(cè)，有3條清晰條帶，RNA完整（見(jiàn)圖2B）。反轉(zhuǎn)錄得到c DNA后作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，只有WT有238 bp的條帶，其他沒(méi)有條帶（見(jiàn)圖2C），證明已成功構(gòu)建了脂蛋白Lpp缺失株ΔLpp。對(duì)驗(yàn)證成功的ΔLpp進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)，取缺失株傳代第43～50次的菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，在996 bp處均有條帶，表明遺傳穩(wěn)定（見(jiàn)圖2D）。2.2 脂蛋白Lpp基因的表達(dá)情況

以16S r RNA為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，WT作為對(duì)照，結(jié)果未檢測(cè)到缺失株中Lpp基因的表達(dá)（見(jiàn)圖3）。2.3 缺失株ΔLpp的生物學(xué)特性分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]維氏氣單胞菌rpoN基因缺失株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性分析[J]. 蔡金雙,王冬雪,單曉楓,康元環(huán),張冬星,田佳鑫.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2020(06)



本文編號(hào)：3522362