禽致病性大腸桿菌（APEC）O₁、O₂和O₇₈是許多地區(qū)田間感染中分離率最高的血清型。已知針對O抗原多糖的特異性免疫應(yīng)答可以對APEC提供免疫保護(hù),目前尚無有效的通過O抗原多糖來預(yù)防APEC感染的疫苗。因此本研究的主要目的是通過構(gòu)建O抗原重組減毒沙門菌以提供對APEC三種血清型的免疫保護(hù)。主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.組裝O抗原多糖的酵母-原核穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建使用PCR擴(kuò)增含有酵母復(fù)制及篩選元件的片段ARS4/CEN5-TRP-Spec和原核復(fù)制及篩選元件的片段ori-asd-T1T2,在Gibson重組酶作用下實(shí)現(xiàn)重組,獲得用于組裝DNA長片段的、含有不同原核復(fù)制起點(diǎn)的酵母-原核穿梭質(zhì)粒pSS25、pSS26、pG8R210和pG8R211。2.編碼APEC O₁、O₂和O₇₈的O抗原基因簇組裝將大小分別為10.9 kb、15.9 kb、13.2 kb、26.9 kb、29.1 kb和40.1 kb的APEC O₁、O₂

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

穿梭質(zhì)粒構(gòu)建流程圖及質(zhì)粒圖譜

圖 2-1 穿梭質(zhì)粒構(gòu)建流程圖及質(zhì)粒圖譜。A 為 TRP1-ARS4/CEN5-Spec 片段。B 為含有不同復(fù)制起點(diǎn)的 T1T2-ori-asd 片段。C 為含有 pSC101和 p15a 復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒圖譜。D 為含有 pBR 和 pUC 復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒圖譜[46]。Fig. 2-1 Construction and plasmids map of pG8R210/ pG8R211 and pSS25/pSS26.A is the fragment of TRP1-ARS4/CEN5-Spec. B is the fragment of T1T2-ori-asd. C is the plasmid map ofpSS25/pSS26. D is the plasmid map of pG8R210/pG8R211[46].3.2 重組質(zhì)粒 PCR 鑒定使用引物 V-F1/R1、V-F2/R2 對構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 鑒定。結(jié)果表明含有重組質(zhì)粒pG8R210、pG8R211、pSS25 和 pSS26 的陽性菌落均能擴(kuò)增出大小為 579 bp 和 695 bp 的片段，與預(yù)期大小相同（圖 2-2A）。其次，分別使用引物 V-F3/R3、V-F4/R3 對重組質(zhì)粒 pSS25 和 pSS26 的 Cen-Trp 原件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示 PCR 擴(kuò)增出大小分別為 1340 bp 和 675 bp 的片段（圖 2-2B、C），表明在原核細(xì)胞中復(fù)制的重組質(zhì)粒也具有酵母復(fù)制原件，提示穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至 1.5 mL 離心管中，高速離心 15 s，棄上清，600 μL 1 ×TE/LiA重懸沉淀，凍存?zhèn)溆谩?.4.2 酵母轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的同源重組(TAR)將待組裝的 DNA 片段（100-200 ng）、線性化質(zhì)粒 pYES1L（100-200 ng）與變性鮭精DNA混合后加入解凍的Mav203感受態(tài)細(xì)胞中，DNA混合液總體積需小于等于（ 10 μL，輕擊混勻各組分后，加入 500 μL 解凍的 PEG/LiAc 溶液，上下翻轉(zhuǎn) 5-8 次充分勻后于30°C水浴30 min，期間間隔10 min翻轉(zhuǎn)一次以混勻各組分。然后加入20 μLDMS上下翻轉(zhuǎn) 5-8 次混合，42°C 熱激 20 min，期間上下翻轉(zhuǎn)充分混合各組分。最后，1800 rp離心 5 min，小心去掉上清，使用 1 mL 滅菌的 0.9% NaCl 重懸，輕輕吹打，從中取 100 μ涂布于 SD-Trp 平板上，30°C 培養(yǎng)三天，PCR 鑒定。參照圖 3-1 所示的方法將截段的 APEC O1、O2和 O78O 抗原基因簇通過 TAR 法組至穿梭質(zhì)粒 pSS26 中。獲得含有 O 抗原基因簇的重組質(zhì)粒 pSS27、pSS28、pG8R206pG8R207、pG8R208 和 pG8R209 等。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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