副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, Hps）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬,是豬上呼吸道的常在菌,該菌引起的感染給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來極大的損失。該菌血清型眾多,毒力因子復(fù)雜,到目前為止發(fā)現(xiàn)了一些副豬嗜血桿菌的毒力因子,但針對不同致病力副豬嗜血桿菌分泌蛋白的差異研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)選取兩株不同致病力副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114菌株作為研究對象,比較其生長特性及致病力,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較并鑒定其對數(shù)期差異分泌蛋白質(zhì),同時利用熒光定量PCR技術(shù)分析差異分泌蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平,具體研究內(nèi)容如下：1副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株生長特性和致病力的比較本試驗(yàn)采用比濁法和平板活菌計(jì)數(shù)兩種方法測量了Nagasaki和SW114株的生長曲線,結(jié)果得知對數(shù)期SW114株生長速度明顯快于Nagasaki株,SW114株穩(wěn)定期持續(xù)時間約為9h,長于Nagasaki株的6h,當(dāng)OD600=0.6時,兩菌株都處于對數(shù)生長期。以體重20-22g 4-8周齡雌性BALB/c小鼠為試驗(yàn)動物,采用改進(jìn)寇氏法鋇Nagasaki和SW114株的半數(shù)致死量,結(jié)果Nagasaki株的半數(shù)致死量... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    1 副豬嗜血桿菌
        1.1 副豬嗜血桿菌及其血清分型
        1.2 副豬嗜血桿菌致病機(jī)制
        1.3 副豬嗜血桿菌的毒力因子
            1.3.1 6-P-葡萄糖酸脫氫酶
            1.3.2 脂寡糖
            1.3.3 細(xì)胞膨脹致死毒素
            1.3.4 免疫球蛋白A蛋白酶
            1.3.5 莢膜
            1.3.6 菌毛
            1.3.7 孔蛋白家族蛋白
            1.3.8 V型蛋白分泌系統(tǒng)
            1.3.9 單體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
            1.3.10 毒力相關(guān)的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        1.4 副豬嗜血桿菌毒力因子鑒定途徑
            1.4.1 通過構(gòu)建缺失突變株鑒別副豬嗜血毒力因子
            1.4.2 通過不同毒力菌株的比較或者特定培養(yǎng)條件下的比較鑒定毒力因子
    2 蛋白質(zhì)組學(xué)概述
        2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生及其研究內(nèi)容
        2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)路線
            2.2.1 雙向凝膠電泳
            2.2.2 質(zhì)譜技術(shù)
            2.2.3 蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)
        2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)菌蛋白篩選方面的應(yīng)用
            2.3.1 篩選疫苗候選蛋白及發(fā)現(xiàn)新蛋白
            2.3.2 篩選病原菌毒力蛋白
            2.3.3 篩選耐藥機(jī)制相關(guān)蛋白
    3 細(xì)菌分泌蛋白組研究進(jìn)展
    4 研究目的及意義
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第一章 副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株生長特性及致病力比較
        1 試驗(yàn)材料
            1.1 試驗(yàn)菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
            1.4 實(shí)驗(yàn)動物
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 Nagasaki和SW114株生長曲線測量
                2.1.1 菌液OD_(600)的測定
                2.1.2 平板活菌計(jì)數(shù)
            2.2 Nagasaki和SW114株致病力比較
                2.2.1 預(yù)試驗(yàn)
                2.2.2 正式試驗(yàn)
                2.2.3 半數(shù)致死量的計(jì)算
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 Nagasaki和SW114株生長曲線
            3.2 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果
            3.3 Nagasaki和SW114株的致病力比較
        4 討論
        5 小結(jié)
    第二章 副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株分泌蛋白的差異分析
        1 試驗(yàn)材料
            1.1 試驗(yàn)菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 分泌蛋白樣品的制備
            2.2 分泌蛋白樣品濃度測定
                2.2.1 分泌蛋白樣品的溶解
                2.2.2 Bradford法定量
            2.3 等點(diǎn)聚焦
                2.3.1 膠條的準(zhǔn)備
                2.3.2 上樣
                2.3.3 放置膠條
                2.3.4 加礦物油
                2.3.5 設(shè)置程序
            2.4 膠條的平衡、轉(zhuǎn)移及SDS-PAGE
                2.4.1 膠條的平衡
                2.4.2 膠條的轉(zhuǎn)移
                2.4.3 SDS-PAGE
            2.5 考馬氏亮藍(lán)G250染色與脫色
            2.6 雙向電泳凝膠圖像掃描
            2.7 圖譜分析及差異蛋白篩選
            2.8 差異蛋白質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索
                2.8.1 質(zhì)譜鑒定
                2.8.2 數(shù)據(jù)庫搜索
        3 結(jié)果
            3.1 蛋白定量結(jié)果
            3.2 組內(nèi)一致性分析
            3.3 雙向電泳凝膠圖像的掃描及差異蛋白點(diǎn)的篩選
            3.4 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定
        4 討論
            4.1 關(guān)于雙向電泳圖譜的構(gòu)建
            4.2 關(guān)于凝膠圖像的分析
            4.3 關(guān)于篩選的差異蛋白
        5 小結(jié)
    第三章 副豬嗜血桿菌差異分泌蛋白轉(zhuǎn)錄水平的研究
        1 試驗(yàn)材料
            1.1 試驗(yàn)菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 副豬嗜血桿菌SW114和Nagasaki株總RNA的抽提
            2.2 cDNA的合成
            2.3 引物合成
            2.4 熒光定量PCR檢測
                2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
                2.4.2 擴(kuò)增曲線的建立
                2.4.3 相對轉(zhuǎn)錄水平的計(jì)算
        3 結(jié)果
            3.1 抽提RNA濃度測定及純度鑒定
            3.2 擴(kuò)增效率的建立
            3.3 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA擴(kuò)增曲線
            3.4 16sRNA、AidA、ompD15和AfuA熔解曲線的建立
            3.5 相對轉(zhuǎn)錄水平差異分析
        4 討論
        5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
讀研期間發(fā)表論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 吳婷,陳金梅,李瑩.  大家健康(學(xué)術(shù)版). 2014(04)
[2]血小板蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 楊義玲,劉文君.  中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2012(03)
[3]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析缺鐵培養(yǎng)對化膿性鏈球菌MGAS5005的影響[J]. 呂潔,余光創(chuàng),孫正華,王南杰,朱穎,王紅翠,孫雪松.  微生物學(xué)通報(bào). 2012(04)
[4]蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有效工具——雙向電泳鑒定技術(shù)[J]. 張穎,楊舸.  重慶文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(05)
[5]蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)技術(shù)進(jìn)展[J]. 馮雪,王彬,黃占景,沈銀柱.  生物學(xué)教學(xué). 2010(03)
[6]蛋白質(zhì)組學(xué)及其技術(shù)發(fā)展[J]. 王英超,黨源,李曉艷,王興龍.  生物技術(shù)通訊. 2010(01)
[7]副豬嗜血桿菌感染豚鼠試驗(yàn)及在其體內(nèi)的分布[J]. 高鵬程,儲岳峰,趙萍,賀英,逯忠新.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(09)
[8]熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用[J]. 朱捷,楊成君,王軍.  生物技術(shù)通報(bào). 2009(02)
[9]蛋白質(zhì)組分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 劉立國,陸慧君,賀文琦,鄧旭明.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2008(01)
[10]柱狀黃桿菌強(qiáng)毒株和弱毒株胞外蛋白中差異蛋白的初步鑒定[J]. 劉國勇,聶品.  中國水產(chǎn)科學(xué). 2007(05)

博士論文
[1]副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]副豬嗜血桿菌分離鑒定及疫苗種用特性研究[D]. 韋劍鋒.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]副豬嗜血桿菌的分離鑒定及蜂膠疫苗的免疫保護(hù)效力研究[D]. 鐘霏.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]副豬嗜血桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AT1的功能研究[D]. 劉莉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]HPS自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的免疫原性及其與宿主細(xì)胞相互作用研究[D]. 張玉娟.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[5]柔嫩艾美耳球蟲菱形蛋白樣蛋白酶（EtROMs）基因的克隆及不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平研究[D]. 王洪成.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[6]PmrA對傷寒沙門菌高滲應(yīng)激后期基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用[D]. 高宇琳.江蘇大學(xué) 2009
[7]豬鏈球菌2型不同溫度條件下分泌蛋白的差異研究[D]. 謝春艷.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



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