旨在建立快速準(zhǔn)確檢測與豬腹瀉相關(guān)的豬Delta冠狀病毒（PDCoV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PRoV）多重PCR檢測方法。針對PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因組序列設(shè)計了4對特異性引物,分別擴增PDCoV N基因（447 bp）、PEDV M基因（204 bp）、TGEV M基因（612 bp）、PRoV VP6基因（329 bp）,經(jīng)過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,成功建立了能同時特異性檢測PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特異性好。應(yīng)用該檢測方法對上海及周邊地區(qū)養(yǎng)殖場臨床豬腹瀉病料進(jìn)行檢測,結(jié)果檢出PEDV陽性樣品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未檢出,與單一RT-PCR檢測結(jié)果完全吻合。該快速檢測方法的成功建立,將有助于提高對PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原學(xué)調(diào)查和疾病監(jiān)測,為生態(tài)養(yǎng)殖提供技術(shù)儲備。 

【文章來源】：畜牧與獸醫(yī). 2020,52(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

多重 RT-PCR 退火溫度的優(yōu)化

在20 μL多重RT-PCR反應(yīng)體系中,把退火溫度固定為51.1 ℃,將4對上下游特異性引物的用量分別設(shè)置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL的梯度,其他條件固定不變,進(jìn)行多重RT-PCR,選取最佳引物濃度。如圖2所示,選取4條擴增條帶最為清晰且用量最少的為最佳引物濃度:0.2 pmol/μL。2.3 多重RT-PCR最佳循環(huán)數(shù)的確定

在20 μL多重RT-PCR反應(yīng)體系中,把退火溫度固定為51.1 ℃,把引物濃度固定為0.2 pmol/μL,其他條件保持不變,將循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為25、30、35、40和45個循環(huán),進(jìn)行多重RT-PCR。結(jié)果如圖3所示,當(dāng)循環(huán)數(shù)為35時,耗時較少且能擴增出較為清晰的目的條帶,因此選取35個循環(huán)數(shù)為最佳循環(huán)數(shù)。經(jīng)過多次反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定多重RT-PCR的反應(yīng)體系。20 μL PCR反應(yīng)體系:2 × green taq mix 10 μL,4對上下游引物均0.2 μL(終濃度為0.2 pmol/μL),4種重組質(zhì)粒等比例混合樣品1 μL,去離子水補足20 μL。PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,51.1 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;16 ℃ 終止2 min。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3509798