目的：中國(guó)美利奴綿羊是我國(guó)新疆特有的肉毛兼用綿羊品種之一，其屠宰加工量非常大。然而，卵巢組織的回收利用率并不高，核移植產(chǎn)生的克隆動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物更是少之又少。目前多使用蛋白激酶抑制劑或蛋白質(zhì)合成抑制劑來(lái)人工激活卵母細(xì)胞，其缺點(diǎn)是不能特異地抑制細(xì)胞周期中某種特定激酶的活性，或某個(gè)特定蛋白質(zhì)的合成。這種方式可能影響卵母細(xì)胞的其他功能，或是對(duì)卵母細(xì)胞激活后的發(fā)育產(chǎn)生不利的影響，進(jìn)而對(duì)卵母細(xì)胞激活后的發(fā)育可能產(chǎn)生有害的影響。因此，需要一種全新的卵母細(xì)胞激活制劑，它既不使用蛋白的合成抑制劑又不使用蛋白磷酸化抑制劑，并可通過(guò)單一增加Ca²⁺來(lái)激活卵母細(xì)胞。它的獲得將能有效地提高優(yōu)質(zhì)囊胚的產(chǎn)出效率。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探究磷脂酶Czeta（PLCζ）是否可以作為一種新的卵母細(xì)胞激活物質(zhì)。方法：（1）用TRIzol法提取了美利奴綿羊睪丸組織總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到了cDNA，以cDNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了PLCζ基因;（2）經(jīng)過(guò)T/A克隆將PLCζ基因與T載體連接，構(gòu)建了克隆載體，然后通過(guò)雙酶切，將PLCζ基因與原核表達(dá)載體pCzn1以及pEGFP-N1真核表達(dá)載體連接；（3）... 

【文章來(lái)源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫(xiě)詞表
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 磷脂酶 C 的研究進(jìn)展
        1.1 磷脂酶 C 發(fā)現(xiàn)
        1.2 磷脂酶 C 的分類(lèi)
    2 受精中 Ca ~(2+)釋放機(jī)制的假說(shuō)
        2.1 受體控制假說(shuō)
        2.2 精子因子假說(shuō)
    3 卵母細(xì)胞的激活方法
        3.1 物理激活
        3.2 化學(xué)激活
        3.3 聯(lián)合激活
    4 PLCζ的特異之處
        4.1 E F 結(jié)構(gòu)域具有較高的 Ca ~(2+) 敏感性
        4.2 PLCζ的 C2 區(qū)域?qū)?Ca ~(2+) 振蕩有重要作用
        4.3 PLCζ的 XY 連接結(jié)構(gòu)具有靶向定位作用
        4.4 精子 PLCζ的缺陷與雄性不育
    5 研究目的及意義
第二章 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
    實(shí)驗(yàn)一 美利奴綿羊 PLCζ基因的克隆及序列分析
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 PLCζ基因的擴(kuò)增與克隆
            2.2 PLCζ蛋白基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析
            2.3 PLCζ蛋白基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
        3 討論
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)二 美利奴綿羊 PLCζ基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 目的基因的擴(kuò)增
            2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.3 原核產(chǎn)物的表達(dá)
            2.4 融合蛋白的純化和 WB 分析
        3 討論
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)三 美利奴綿羊 PL Cζ基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 目的基因的擴(kuò)增
            2.2 pEGFP- N1 - PLCζ重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.3 pEGFP- N1- PLCζ重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞
            2.4 pEGFP- N1 - PLCζ重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)四 美利奴綿羊 PLCζ基因在卵母細(xì)胞中表達(dá)的初步研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2. 結(jié)果
            2.1 卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)
            2.2 卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)粒的顯微注射
        3. 討論
        4. 小結(jié)
全文總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師評(píng)閱表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]p21-EGFP融合基因表達(dá)載體與卵母細(xì)胞的表達(dá)定位[J]. 武迪迪,張杰,具英花,宗志宏,李雪松,于秉治.  貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2007(01)
[2]綿羊精子提取物對(duì)卵母細(xì)胞的孤雌激活作用[J]. 賽務(wù)加甫,張立,彭新榮,郭志林,楊麗,李向臣,何寬軍,安志興,張涌.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2006(07)
[3]蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮（CHX）對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J]. 李光鵬,孟慶剛,魏鵬,于元松,常仲樂(lè),譚景和.  動(dòng)物學(xué)報(bào). 2001(06)



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