發(fā)布時間：2021-11-18 09:51

　　口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virues,FMDV）引起的偶蹄動物的一種烈性傳染病,其嚴重損害畜牧業(yè)的生產(chǎn),每年都造成巨大的經(jīng)濟損失。FMDV屬于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的成員。與微RNA病毒科其他病毒成員一樣,FMDV基因組缺乏5’端帽子結(jié)構,其蛋白翻譯的起始依賴于5’非編碼區(qū)的內(nèi)部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site,IRES）。越來越多的研究證實,IRES介導翻譯的調(diào)控是病毒感染的關鍵步驟,對病毒的毒力、致病性以及組織嗜性具有重要的影響。因此,深入研究病毒IRES元件介導的翻譯調(diào)控機制,對闡明FMDV的致病機理具有重要意義。在本實驗室的前期研究中,通過RNA pulldown方法結(jié)合質(zhì)譜分析篩選獲得8個與FMDV IRES相互作用的宿主細胞蛋白。本研究選取其中的hnRNP K蛋白進行深入的研究。hnRNP K屬于hnRNP蛋白家族的成員,是一種多功能蛋白,通過與核酸和蛋白相互作用參與細胞的調(diào)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

口蹄疫病毒基因組結(jié)構（引自Gaoetal.2016）

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第一章緒論7接與5"UTR中的S片段和IRES元件相互作用，從而影響FMDV的感染性和復制(GARCA-NUEZetal.,2014)。其中，IRES元件通過同時結(jié)合3"UTR的兩個莖環(huán)結(jié)構且以不依賴poly(A)尾的方式與3"UTR相互作用，從而增強IRES活性；而S片段通過依賴poly(A)尾的方式分別與3"UTR的莖環(huán)結(jié)構相互作用。3"UTR除了直接的RNA-RNA相互作用，其5"-3"末端連接也可能通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-RNA相互作用的方式調(diào)控FMDV的翻譯(SERRANOetal.,2006)。圖1-2口蹄疫病毒基因組5"端非編碼區(qū)的結(jié)構（引自Masonetal.2003）Fig.1-2ThestructureofFMDV5"untranslationregion(RetrievedfromMasonetal.2003)1.2.5口蹄疫病毒的翻譯調(diào)控元件IRESIRES元件是一個獨特的RNA分子，大約450nt，其GC含量較高，具有復雜且穩(wěn)定的高級結(jié)構。目前，根據(jù)病毒IRES的結(jié)構與功能，可將其分為5類，其中FMDV和EMCV的IRES均屬于II型IRES(PILIPENKOetal.,1989;SWEENEYetal.,2012)。FMDVIRES包含4個高度結(jié)構化的結(jié)構域，結(jié)構域II（DomainII）的莖環(huán)頂部存在高度保守的UCUUU基序，為PTB蛋白提供結(jié)合位點(FAJARDOetal.,2012)；結(jié)構域III（DomainIII）是FMDVIRES元件中最大的、處于中間位置的結(jié)構域，其頂端區(qū)域包括兩個保守的GNRA和RAAA（N是任何核苷酸，R代表嘌呤）基序，而中間區(qū)域是保守的胞嘧啶富集基序（C-richmotif）(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002)，GNRA與RAAA基序?qū)Ψ�(wěn)定IRES元件的二級結(jié)構起著重要作用，修飾GNRA的5"-G或3"-A殘基會大大降低FMDVIRES的活性，而RAAA突變將會導致FMDVIRES失去活性(FERNNDEZetal.,2011;LPEZDEQUINTOetal.,2002;ROBERTSONetal.,1999)。此外，結(jié)構域III對FMDV復制過程中的RNA-RNA和RNA-蛋白質(zhì)相互作用中也起著關鍵作用(FER

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章hnRNPK與口蹄疫病毒相互作用調(diào)控病毒復制的分子機制24圖2-1hnRNPK與FMDVIRES相互作用（A-C）FMDVIRES與不同種屬細胞的hnRNPK發(fā)生相互作用。BHK-21、IBRS-2、pBK細胞的裂解液分別與生物素標記的FMDVIRES共孵育，未標記FMDVIRES、Biotin-16-UTP和無RNA作為對照。用hnRNPK特異性抗體進行RNApulldown試驗和免疫印跡分析。（D-E）競爭結(jié)合試驗證實hnRNPK與FMDVIRES特異性相互作用。RNApulldown試驗中加入不同梯度劑量的未標記RNA（FMDVIRES和酵母tRNA），與生物素標記的FMDVIRES競爭結(jié)合hnRNPK，并用hnRNPK抗體進行免疫印跡分析。（F）hnRNPK與FMDVIRES直接的相互作用。原核表達純化的hnRNPK蛋白與生物素標記的FMDVIRES共孵育，GST蛋白作為對照。用GST抗體進行RNApulldown試驗和免疫印跡分析。（G）在FMDV感染細胞中hnRNPK與FMDV基因組RNA的相互作用。FMDV（MOI,1）接種BHK-21細胞6h后收集細胞裂解液，分別用圖中顯示的抗體進行RNA免疫共沉淀。Fig.2-1InteractionofhnRNPKwiththeFMDVIRES(A-C)TheFMDVIRESinteractswithhnRNPKinvariouscelllines.TheextractsofBHK-21,IBRS-2orpBKcellswereincubatedwiththebiotinylatedFMDVIRES,thenonbiotinylatedFMDVIRES,Biotin-16-UTPornoRNAusedasnegativecontrols.RNApulldownassaysandimmunoblotanalysiswereperformedwithananti-hnRNPKantibody.(D-E)SpecificassociationbetweenhnRNPKandFMDVIRESwasconfirmedbycompetitionassays.VariousamountsofunlabeledRNA(FMDVIRESoryeasttRNA)wereaddedtocompetewiththebiotin-labeledFMDVIRESforbindinghnRNPKinRNA-proteinpulldownassaysandanalyzedbyWesternblottingusingananti-hnRNPKantibody.(F)PurifiedGST-hnRNPK(50μg)wasincubat

【參考文獻】：
期刊論文
[1]O型泛亞譜系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J]. 楊德成,涂亞斌,王海偉,周國輝,于力.  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(01)



本文編號：3502682