產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱魏氏梭菌（C.welchii）,呈桿狀,革蘭陽性菌,廣泛存在于自然界中,是一種危害性較強的人畜共患病病原體,主要引起人和多種動物的食物中毒,創(chuàng)傷性壞疽或氣性壞疽,分泌性、壞死性或者出血性腸炎,腸毒血癥,痢疾等。該病具有發(fā)病急、病程短、死亡率高的特點,經常會導致動物的急性死亡,對人類健康及養(yǎng)殖業(yè)具有較大的威脅。產氣莢膜梭菌本身并無侵襲力,致病性主要由其分泌外毒素作用所致。根據4種主要毒素α（CPA）、β（CPB）、ε（Etx）、iota（Cpi）的產生情況將產氣莢膜梭菌劃分為A、B、C、D、E 5種毒素型。由于產氣莢膜梭菌所致的疾病具有發(fā)病急、病程短的特點,往往不能及時發(fā)現(xiàn),導致常規(guī)藥物很難得到理想效果,疫苗是最主要的預防手段。當前廣泛使用的疫苗主要為多聯(lián)苗。這些疫苗主要成分為滅活菌體或者是類毒素或者是將其混合組成,其具有一些缺點如抗原成分復雜,有效抗原成分少,易引起免疫副反應,重組疫苗可能是一個解決方案。已有研究證明表達產氣莢膜梭菌α毒素C末端CPA^247-370能夠賦予小鼠高的保護率;具有H106... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

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【學位級別】：碩士

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產氣莢膜梭菌Cp-abx抗原決定簇軟件分析

山東農業(yè)大學碩士學位論文323.2大腸桿菌表達載體PET28a-abx的構建用PCR擴增產氣莢膜梭菌Cp-abx融合基因片段，并用核酸電泳檢測，照膠儀中顯示出與預期大小的目的條帶（如圖2A所示），目的條帶大小為1941bp，之后，膠回收Cp-abx融合蛋白的PCR產物，送往青島睿博興科生物科技有限公司測序。鑒定結果正確后連接克隆載體質粒pEASY-Blunt3，進行雙酶切與測序驗證，雙酶切后進行凝膠電泳檢測后出現(xiàn)了特異性目的條帶（如圖2B所示），測序結果顯示，目的片段成功連接在克隆載體上。將雙酶切片段，與相同內切酶酶切后的表達質粒pET-28a(+)4℃過夜連接。同樣用酶切、測序兩種方法進行驗證（如圖2C所示）。連接大腸桿菌重組表達載體pET-28a(+)，同樣和空載體分別用熱激法轉入BL21（DE3）。用氨芐抗性篩選出陽性轉化子，測序鑒定結果準確。結果表明：重組表達質粒pET-28a(+)-Cp-abx成功轉化到了BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。圖2產氣莢膜梭菌Cp-abx大腸桿菌重組質粒PCR鑒定圖Fig.2PCRamplificationofrecombinantplasmidofClostridiumperfringensCp-abx注：(A)PCR擴增Cp-abx電泳圖;(B)連接Blunt3載體酶切鑒定圖;(C)pET-28a(+)-Cp-abx重組表達質粒酶切鑒定圖Note:(A)PCRamplificationofCp-abx;(B)DigestionofrecombinantplasmidBlunt3-Cp-abxbyXhoⅠ和NcoⅠ;(C)DigestionofrecombinantplasmidpET-28a(+)-Cp-abxbyXhoIandNcoI

產氣莢膜梭菌α-β-ε毒素融合蛋白的表達及其免疫原性分析333.3Cp-abx融合蛋白在大腸桿菌原核表達、鑒定及純化培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加入IPTG誘導不同時間，進行SDS-PAGE檢測，圖3A為誘導表達不同時間蛋白表達量。可以顯示重組質粒pET-28a(+)-Cp-abx轉化BL21（DE3）誘導表達的產物可以出現(xiàn)大小約為71.15kDa的特異性條帶，和預期表達蛋白大小相符。目的蛋白經純化后，經SDS-PAGE分析，可見凝膠中只剩一條大小約為71.15kDa的條帶。為了進一步鑒定蛋白表達的正確與否，用WesternBlot技術對目標蛋白的HIS標簽、ETXH106P進行特異性驗證，一抗分別為鼠抗HIS標簽單克隆抗體、鼠抗ETXH106P蛋白多克隆抗體；二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，DAB顯色試劑盒顯色后�？梢娪�71.15kDa大小的條帶（如圖3B、C所示），與上述SDS-PAGE蛋白條帶結果相吻合。因此，在本試驗中，Cp-abx融合蛋白，在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中被成功表達，且特異性良好。圖3(A)重組蛋白的SDS-PAGE(B)抗HISWesternblot分析(C)抗ETXH106PWesternblot分析Fig.3SDS-PAGE、WesternblottingoftheCp-abxprotein.注：(A)不同誘導時間下的SDS-PAGE鑒定圖，M：蛋白Marker；1為陰性對照，2-7依次為表達1h、2h、3h、4h、5h、6h的產物。(B)不同誘導時間下的Westernblotting鑒定圖（抗HIS標簽）。M：蛋白Marker；1為陰性對照，2-7依次為表達1h、2h-6h的產物。(C)Westernblotting鑒定圖。M：蛋白Marker；1：陰性對照；2：抗ETXH106P。Note：(A)SDS–PAGEidentificationatdifferentinductiontimes.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.lanes2-7,transformedwithrecombinantplasmidsafter1,2,3,4,5and6hofIPTGinduction;(B)Westernblottingidentification.M:proteinmarker;lane1,negativecontrol.;lane2-7:transf

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3499012