發(fā)布時間：2021-11-12 14:47

　　豬瘟（classical swine fever,CSF）是一種以高熱稽留和廣泛性出血為主要特征的豬的高度傳染性疾病,對我國乃至全球多個國家的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,我國主要采取免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗株（C株或HCLV株）的措施來預(yù)防豬瘟。C株是一株集良好的安全性和免疫原性于一身的弱毒疫苗株,在全球豬瘟的防控中發(fā)揮了重要作用。但是,現(xiàn)階段還沒有商品化的標(biāo)記C株疫苗可用,這使得在臨床上區(qū)分野毒感染與疫苗接種（differentiation between infected and vaccinated animals,DIVA）還存在一定的技術(shù)障礙。因此,我們需要將C株開發(fā)為標(biāo)記疫苗株,使其具備標(biāo)記的特性,在豬瘟凈化工作上繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),單克隆抗體（monoclonal antibody,MAb）HQ06是CSFV E2蛋白的特異性抗體,并鑒定其識別的抗原表位為¹¹⁶LFDGTNP¹²²,且¹¹⁷F、¹¹⁹G和¹²²P是該表位的3個關(guān)鍵氨基酸。本研究... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CSFV基因組結(jié)構(gòu)示意圖（MURRAYetal.,2008）

為丙氨酸（A）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A以及CSFVE2蛋白LFDGTNP抗原表位第122位脯氨酸（122P）突變?yōu)楸彼幔ˋ）的C株感染性克隆pHCLV-E2G119A。之后，利用核酸限制性內(nèi)切酶和二代測序?qū)Λ@得的3個感染性克隆進(jìn)行鑒定和基因測序。同時，將上述測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到商品化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B中，通過挑取陽性的單克隆，對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌進(jìn)行大量擴(kuò)增。最終取300mL的菌液按照無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒的操作說明說進(jìn)行質(zhì)粒提取工作，提取的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定驗(yàn)證無誤后，保存-20℃用于后續(xù)試驗(yàn)。圖2-1感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的構(gòu)建示意圖Fig.2-1SchematicrepresentationofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A.

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章基于反向遺傳技術(shù)的豬瘟病毒標(biāo)記C株的構(gòu)建及其免疫原性評價192.2結(jié)果2.2.1感染性克隆的酶切鑒定用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII對構(gòu)建的3個感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A進(jìn)行鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示，用HindIII對構(gòu)建的3個感染性克隆進(jìn)行酶切后，得到的基因片段與預(yù)期大小一致（圖2-2）。同時，利用針對CSFVE2基因的特異性引物對構(gòu)建的3個感染性克隆的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后送測序。測序結(jié)果表明，3個感染性克隆的基因序列與預(yù)期一致。這說明嵌合病毒的感染性克隆構(gòu)建成功。圖2-2感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的酶切分析圖Fig.2-2RestrictionenzymeanalysisofpHCLV-E2F117A,pHCLV-E2G119AandpHCLV-E2P122A2.2.2突變體病毒的拯救我們將獲得的3個感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A分別轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞，連續(xù)傳代拯救3株突變體病毒，用CSFV抗原檢測試劑盒（IDEXX）對第5代和第7代的SK6細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，所拯救的第7代病毒的Erns蛋白抗原為陽性（圖2-3）。按照病毒RNA提取說明書提取拯救的病毒基因組RNA，之后通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行測序。結(jié)果表明，3株突變體病毒基因組的目的基因與預(yù)期的大小一致，測序結(jié)果顯示突變體病毒的目的基因不存在其它突變。以上結(jié)果表明，我們獲得了CSFVE2蛋白的LFDGTNP抗原表位3個關(guān)鍵氨基酸突變的突變體病毒。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]豬瘟病毒E2蛋白酵母表達(dá)及其免疫活性的初步研究[D]. 周穩(wěn).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2019
[2]豬瘟疫苗C株WH303表位突變毒株的構(gòu)建及在細(xì)胞和兔體中特性研究[D]. 劉元杰.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 2018
[3]豬瘟病毒E0-E2基因重組雞痘病毒遺傳穩(wěn)定性和免疫劑量研究[D]. 張浩.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2008



本文編號：3491128