為了鑒定miR-10a-5p與豬E2F3基因的靶向關(guān)系,試驗(yàn)從生物信息miRNA Base數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)miR-10a-5p的相關(guān)信息,并運(yùn)用MEGA 6.0軟件分析其保守性,通過(guò)Target Scan生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)其潛在的靶基因及結(jié)合位點(diǎn),然后PCR擴(kuò)增E2F3基因3′非編碼區(qū)（3′UTR）片段,構(gòu)建E2F3的野生型（E2F3-3′UTR-wt）和突變型（E2F3-3′UTR-mut）雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,并分別與miR-10a-5p mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,檢測(cè)雙熒光素酶活性變化。結(jié)果表明:miR-10a-5p在7個(gè)物種間具有高度保守性,成熟序列均為UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在內(nèi)的共241個(gè)潛在的靶基因;E2F3基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大小約1 288 bp的清晰條帶,測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致;轉(zhuǎn)染miR-10a-5p mimics能顯著降低豬E2F3基因野生型質(zhì)粒雙熒光素酶活性（P<0.05）。說(shuō)明豬E2F3基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)... 

【文章來(lái)源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(15)北大核心

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E2F3-3′UTR-mut PCR 鑒定結(jié)果

E2Fs基因家族編碼的蛋白質(zhì)可作為促進(jìn)細(xì)胞周期S期進(jìn)程的一種激活劑,當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞處于S期和G2期時(shí),E2F3a等活化劑均以蛋白酶體和糖基化依賴(lài)性方式降解[13]。E2F3基因作為E2Fs基因家族中的一員,參與多種細(xì)胞的增殖、分化[14]、周期和凋亡等過(guò)程。如miR-363可以靶向調(diào)控E2F3基因,對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用,并促進(jìn)其凋亡[15];E2F3基因還能夠被miR-152顯著下調(diào),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16];并且E2F3基因沉默能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系的凋亡[17];通過(guò)干擾E2F7基因的表達(dá)可以極顯著促進(jìn)E2F3的表達(dá)(P<0.01),同時(shí)極顯著促進(jìn)與成肌細(xì)胞增殖相關(guān)microRNAs的表達(dá)[18]。上述研究結(jié)果均表明,E2F3基因?qū)Χ喾N細(xì)胞的增殖能夠起到一定調(diào)節(jié)作用,但目前關(guān)于豬成肌細(xì)胞中對(duì)E2F3基因作用機(jī)制方面的研究報(bào)道少見(jiàn)。本試驗(yàn)首先通過(guò)生物信息miRNA Base數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在多物種之間具有較高的保守性,并預(yù)測(cè)到E2F3基因存在與miR-10a-5p結(jié)合的3′UTR結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)可能是其靶基因。進(jìn)一步構(gòu)建E2F3基因的野生型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,并通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒分別與miR-10a-5p mimics和mimics NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中檢測(cè)熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p mimics+E2F3-3′UTR-wt組的熒光素酶活性顯著降低。上述試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miR-10a-5p可以通過(guò)預(yù)測(cè)的位點(diǎn)與E2F3基因靶向結(jié)合,且miR-10a-5p對(duì)E2F3基因表達(dá)具有顯著抑制作用,為進(jìn)一步研究miR-10a-5p對(duì)豬肌肉發(fā)育是否產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)分析了不同物種miR-10a-5p的成熟序列,發(fā)現(xiàn)其具有較高的保守性,利用Target Scane生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-10a-5p與E2F3基因可能存在結(jié)合位點(diǎn),并成功構(gòu)建了E2F3基因3′UTR的野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p與E2F3基因之間存在靶向關(guān)系,為探索兩者對(duì)豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的作用提供了理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]干擾E2F7對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖的影響[J]. 范源,甘麥鄰,羅嘉,譚婭,張順華,朱礪.  云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)). 2019(03)
[2]miR-363靶向調(diào)控E2F3表達(dá)影響HepG2細(xì)胞增殖和凋亡研究[J]. 姜哲,舒敏,王媛媛,樸蓮淑.  實(shí)用肝臟病雜志. 2018(06)
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博士論文
[1]豬不同年齡段肌肉組織microRNAs鑒定和差異表達(dá)分析[D]. 周朝偉.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]MicroRNA-10a-5p在大鼠心衰發(fā)展中的作用和機(jī)制研究[D]. 尚佳.寧夏醫(yī)科大學(xué) 2017
[2]miR-125a-5p在C2C12細(xì)胞增殖分化中的作用及機(jī)制研究[D]. 宋成創(chuàng).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[3]E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響[D]. 王密.天津醫(yī)科大學(xué) 2011



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