腸毒素大腸桿菌K88（ETEC K88）是一種常見(jiàn)的腸道微生物,也是引起仔豬腹瀉和死亡的主要致病微生物。養(yǎng)殖業(yè)中準(zhǔn)確、低成本、簡(jiǎn)便、快速地找出引起仔豬腹瀉的原因及微生物的種類甚至是血清型一直是一個(gè)難以攻克的難題,一些很好的生物產(chǎn)品如疫苗、卵黃抗體等也因此在仔豬疾病預(yù)防和治療中的不能大規(guī)模低成本應(yīng)用。建立和完善針對(duì)于ETEC K88的低成本、簡(jiǎn)便、快速分析檢測(cè)體系并實(shí)現(xiàn)在養(yǎng)殖業(yè)中的商業(yè)化應(yīng)用是降低這一類致病微生物引起的仔豬死亡的重要手段。本文以ETEC K88為目標(biāo)模式菌,利用生物學(xué)方法篩選和制備以K88菌毛蛋白為靶標(biāo)的單克隆抗體和適配體、以ETEC K88菌體為靶標(biāo)的細(xì)胞適配體和適配體文庫(kù),鑒定了它們與靶標(biāo)的結(jié)合性能,初步構(gòu)建了基于這幾種生物探針的檢測(cè)體系分別用于K88菌毛蛋白和ETEC K88菌體的快速檢測(cè)分析。同時(shí),成功建立了一個(gè)新的FluMag-Cell-SELEX （FluMag Cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment）細(xì)胞適配體篩選方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：本文優(yōu)化了ETEC K88的發(fā)酵工藝,在... 

【文章來(lái)源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言與文獻(xiàn)綜述
    1.1 腸毒素大腸桿菌ETEC K88
        1.1.1 大腸桿菌
        1.1.2 腸毒素大腸桿菌(ETEC)
        1.1.3 ETEC菌毛
        1.1.4 ETEC K88和K88菌毛
    1.2 大腸桿菌引起的仔豬腹瀉
        1.2.1 仔豬黃痢
        1.2.2 仔豬白痢
        1.2.3 斷奶仔豬腹瀉
    1.3 大腸桿菌的檢測(cè)方法
        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法和血清型鑒定
        1.3.2 新型快速檢測(cè)方法
    1.4 用于大腸桿菌檢測(cè)的生物探針
        1.4.1 核酸(DNA)探針
        1.4.2 抗體探針
        1.4.3 適配體探針
    1.5 適配體
        1.5.1 適配體與靶目標(biāo)的結(jié)合
        1.5.2 適配體的篩選(SELEX技術(shù))
        1.5.3 適配體作為探針與抗體的比較優(yōu)勢(shì)
    1.6 本課題研究的工作思路和主要內(nèi)容
第二章 K88菌毛蛋白的提取純化和單克隆抗體的制備
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 其他試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        2.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的單克隆抗體制備
        2.2.3 K88菌毛蛋白單克隆抗體生物素標(biāo)記及Western Blot鑒定
        2.2.4 K88菌毛蛋白單克隆抗體親和力測(cè)定
        2.2.5 K88菌毛蛋白單克隆抗體效價(jià)測(cè)定
        2.2.6 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結(jié)合性能分析
        2.2.7 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結(jié)合特異性分析
        2.2.8 基于K88菌毛蛋白單克隆抗體的ABS-ELISA體系對(duì)K88菌毛蛋白的檢測(cè)靈敏度分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.3.1 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        2.3.2 ETEC K88菌毛蛋白單克隆抗體的篩選和制備
        2.3.3 K88菌毛蛋白單克隆抗體效價(jià)測(cè)定
        2.3.4 K88菌毛蛋白單克隆抗體的親和力測(cè)定
        2.3.5 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結(jié)合性能分析
        2.3.6 K88菌毛蛋白單克隆抗體與ETEC K88的結(jié)合特異性分析
        2.3.7 基于K88菌毛蛋白單克隆抗體的ABS-ELISA體系檢測(cè)ETECK88菌毛蛋白的靈敏度分析
    2.4 討論和小結(jié)
第三章 EIECK88菌毛蛋白適配體的篩選、鑒定及利用Aptamer-ABS-ELISA方法快速分析ETEC K88菌毛蛋白
    3.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        3.1.3 主要試劑配制
        3.1.4 其他試劑
        3.1.5 隨機(jī)SSDNA文庫(kù)的構(gòu)建以及引物合成
        3.1.6 適配體的合成和修飾
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)菌的準(zhǔn)備和稀釋平板菌落計(jì)數(shù)(MPN)
        3.2.2 ETEC K88菌毛蛋白的制備
        3.2.3 SELEX過(guò)程
        3.2.4 膠回收純化ssDNA文庫(kù)
        3.2.5 富集文庫(kù)與K88菌毛蛋白的結(jié)合率分析
        3.2.6 測(cè)序
        3.2.7 克隆序列分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.2.8 K88菌毛蛋白適配體親和力測(cè)定
        3.2.9 K88菌毛蛋白適配體和ETEC K88的結(jié)合性能分析
        3.2.10 K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結(jié)合特異性分析
        3.2.11 基于適配體的Aptamer-ABS-ELISA法檢測(cè)ETEC K88菌毛蛋白體系檢測(cè)ETEC K88的靈敏度分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 富集文庫(kù)與K88菌毛蛋白的結(jié)合率分析
        3.3.2 克隆序列一級(jí)結(jié)構(gòu)序列同源性分析
        3.3.3 候選適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.3.4 候選K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結(jié)合性能分析
        3.3.5 K88菌毛蛋白適配體親和力測(cè)定
        3.3.6 K88菌毛蛋白適配體和ETEC K88的結(jié)合性能分析
        3.3.7 K88菌毛蛋白適配體與ETEC K88的結(jié)合特異性分析
        3.3.8 基于K88菌毛蛋白適配體的APTAMER-ABS-ELISA法檢測(cè)ETEC K88菌毛蛋白體系的靈敏度分析
    3.4 討論和小結(jié)
第四章 不同CELL-SELEX技術(shù)篩選ETEC K88細(xì)胞適配體
    4.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        4.1.3 主要試劑配制
        4.1.4 其他試劑
        4.1.5 隨機(jī)SSDNA文庫(kù)的構(gòu)建以及引物合成
        4.1.6 適配體的合成和修飾
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)菌的準(zhǔn)備和稀釋平板菌落計(jì)數(shù)(MPN)
        4.2.2 經(jīng)典CELL-SELEX過(guò)程(離心分離法)
        4.2.3 熒光磁珠法CELL-SELEX(FLUMAG-CELL-SELEX)過(guò)程
        4.2.4 SSDNA文庫(kù)的膠回收和純化
        4.2.5 反篩(COUNTER-SELEX)
        4.2.6 富集文庫(kù)與K88菌毛蛋白的結(jié)合率分析
        4.2.7 測(cè)序
        4.2.8 克隆序列分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        4.2.9 K88免疫磁珠(K88 IMB)的可靠性研究
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 K88 IMB的可靠性研究
        4.3.2 經(jīng)典SELEX技術(shù)篩選ETEC K88細(xì)胞適配體
        4.3.3 FLUMAG-CELL-SELEX技術(shù)篩選ETEC K88細(xì)胞適配體
        4.3.4 兩種SELEX技術(shù)篩選ETEC K88細(xì)胞適配體對(duì)比
    4.4 討論和小結(jié)
第五章 基于細(xì)胞適配體/細(xì)胞適配體文庫(kù)直接熒光探針?lè)治雠c免疫磁分離技術(shù)相結(jié)合快速檢測(cè)ETEC K88研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 菌種和培養(yǎng)基
        5.1.3 主要試劑配制
        5.1.4 其他試劑
        5.1.5 適配體的合成和修飾
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 細(xì)菌的準(zhǔn)備和稀釋平板菌落計(jì)數(shù)(MPN)
        5.2.2 FITC修飾的適配體文庫(kù)的擴(kuò)增
        5.2.3 ETEC K88細(xì)胞適配體親和力測(cè)定
        5.2.4 ETEC K88細(xì)胞適配體和細(xì)胞適配體文庫(kù)(Aptamer library)與ETEC K88的結(jié)合性能分析
        5.2.5 基于細(xì)胞適配體/適配體文庫(kù)的直接熒光分析法-IMS技術(shù)相結(jié)合快速分析檢測(cè)ETEC K88
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 ETEC K88細(xì)胞適配體親和力測(cè)定
        5.3.2 ETEC K88細(xì)胞適配體和細(xì)胞適配體文庫(kù)與ETEC K88的結(jié)合性能分析
        5.3.3 基于細(xì)胞適配體/適配體文庫(kù)的直接熒光探針?lè)治?IMS技術(shù)相結(jié)合快速分析檢測(cè)ETEC K88
    5.4 討論和小結(jié)
第六章 結(jié)論和展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間撰寫(xiě)、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3488723