禽流感的頻繁暴發(fā),給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,甚至危及人類的身體健康和生命安全。隨著禽類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,將具有抗流感病毒活性的基因?qū)雱游矬w內(nèi),培育具有抗禽流感特性的轉(zhuǎn)基因雞新品種,已成為重要的研究目標。但由于高致病性禽流感具有潛伏期短、發(fā)病急劇的特性,僅導(dǎo)入一種抗病毒基因很難達到理想目標。培育整合兩種或兩種以上候選基因的抗病毒轉(zhuǎn)基因雞新品種將是未來的研究方向。以本實驗室成功篩選出的抗高致病性禽流感病毒H5N1FJ13株的siRNA NP604和抗HA蛋白的單鏈抗體可變區(qū)分子scFv1、scFv2和scFv3為基礎(chǔ),開展了一系列研究,獲得了如下研究結(jié)果：首先通過ELISA實驗,篩選出了與病毒結(jié)合能力較強的scFv1分子。用插入了scFv1基因的分泌型真核表達載體pIRES2-scFv1和siRNA NP604真核表達載體psiSTRIKE-NP604轉(zhuǎn)染DF-1細胞,轉(zhuǎn)染成功后感染AIV FJ13株病毒。通過Real-time PCR檢測,結(jié)果顯示從感染后12h到60h,同時轉(zhuǎn)入兩種抗病毒基因的細胞中病毒的拷貝數(shù)明顯低于僅轉(zhuǎn)入一種基因的細胞（P<0.05）。將在細胞內(nèi)穩(wěn)定... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

禽流感病毒在野禽和家禽間的傳播（PascuaandChoi，2014)

圖1-2 2003-2013年全球確診為人感染AlV H5M的區(qū)域分布(弓 I 自 http: iiamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchRcsulis.aspx)Figure 1-2 Areas with confirmed human cases for avian influenza A (H5N1) reported to W HO, 2003-2013(弓 I 自 http: aamapscr\ cr.\vho.int/mapLibrar\ /app/searchRcsults.asp\ )1.1.1禽流感病毒概述流感病毒根據(jù)其核蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白（MS)抗原性的不同分為甲（A)、乙（B)、丙（C)三型，它們之間的抗原性可通過瓊脂糖擴散試驗、補體結(jié)合試驗等加以區(qū)別（殷震，劉景華，1997)。根據(jù)A型流感病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白血凝素（hemagglutinin, HA )和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA )抗原性的不同，將其分為不同的血清亞型，己發(fā)現(xiàn)有]6種不同的HA亞型（H1-H16)和9種NA亞型（N1-N9) (Lee and Saif, 2009)。禽流感病毒屬于A型流感病毒，包括多種亞型，至今發(fā)現(xiàn)能直接感染人的禽流感病毒亞型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2 禾卩 H7N9 亞型。

圖1-3 A型流感病毒的結(jié)構(gòu)示意圖（Subbarao and Joseph, 2007)Figure 1-3 Schematic of an influenza A virus (Subbarao and Joseph, 2007)禽流感病毒是單股負鏈RNA病毒，基因組分為8個節(jié)段，編碼10種蛋白質(zhì)（圖1-3)。RNA聚合酶PB]、PB2和PA在功能上各有分工，PB〗是在病毒mRNA合成起始后使之逐漸延長；PB2的作用是在病毒mRNA轉(zhuǎn)錄的起始階段識別并結(jié)合在5’端I型帽狀結(jié)構(gòu)上，同時PB2還具有限制性內(nèi)切酶的活性，參與宿主mRNA帽狀結(jié)構(gòu)的切割；在流感病毒RNA復(fù)制的過程中，PA主要負責將模板RNA不斷傳遞至聚合酶的活性中心。血凝素（Hemagglutinin.HA)和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA)都是構(gòu)成病毒囊膜纖突的重要蛋白。HA在病毒的吸附、跨膜過程以及決定病毒的宿主特異性中起著關(guān)鍵作用，能否被裂解為HA]和HA2兩部分是病毒感染細胞的先決條件，也是決定病毒致病力的主要因素（Vogel，1998)o NA的主要作用則是水解細胞表面的特異性糖蛋白末端的N-乙酷基神經(jīng)氨酸（唾液酸），避免病毒粒子聚集，有利于病毒的釋放，影響病毒在感染細胞周圍的擴散能力。NP是一種單體隣酸化的多肽，它是構(gòu)成病毒核衣殼的主要蛋白成分（Yewdell et al.，]985)。第7節(jié)段RNA編碼的蛋白被稱為Ml,部分分子量較小的蛋白稱為M2。Ml構(gòu)成病毒的基質(zhì)膜，具有型特異性，

【參考文獻】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在動物遺傳育種上的應(yīng)用[J]. 祝鐵鋼.  畜牧與飼料科學(xué). 2010(02)
[2]轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J]. 張然,徐慰倬,孔平,許紅韜,李寧.  中國生物工程雜志. 2005(08)



本文編號：3488075