巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌分別是引起豬巴氏桿菌病、豬鏈球菌病、豬支原體肺炎、豬傳染性胸膜肺炎和格拉瑟氏病的主要病原,也是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)常見的五種呼吸系統(tǒng)疾病病原菌。這五種病原菌均可引起豬的呼吸道疾病,且引起的臨床癥狀和病理變化通過肉眼觀察有時難以區(qū)分。有時還存在這幾種病原菌混合感染的情況,更給疾病的診斷造成困難。為了有效鑒定這些病原菌,本課題擬建立一種同時鑒定這五種病原的PCR診斷方法。1.豬呼吸系統(tǒng)病原菌單重PCR檢測方法的建立目的:建立豬呼吸系統(tǒng)病原菌的單重PCR檢測方法。方法:針對巴氏桿菌plpE基因、豬鏈球菌gdh基因、豬肺炎支原體mhp677基因、胸膜肺炎放線桿菌apxⅣ基因和副豬嗜血桿菌vanY基因序列各設(shè)計1對引物,確定每種病原單重PCR的退火溫度和敏感性,驗證引物的特異性。結(jié)果:確定五種病原單重PCR擴增的退火溫度范圍為54℃-60℃,每對引物均為相應(yīng)病原菌特異的引物。plpE基因的最低檢出限為0.01 ng/μL,gdh基因的最低檢出限為0.1 ng/μL,mhp677基因的最檢出限為0.1 ng/μL,apxⅣ基因的最低檢出限為0.... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

使用不同的退火溫度擴增巴氏桿菌plpE基因片段

第3章豬呼吸系統(tǒng)病原菌單重PCR檢測方法的建立31圖3.2使用不同的退火溫度擴增豬鏈球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火溫度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3豬肺炎支原體mhp677基因片段退火溫度的確定分別以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火溫度擴增mhp677基因片段。在退火溫度為30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃時，擴增出一條與目的片段大小相同的526bp的條帶；在退火溫度為66℃和72℃時，沒有條帶擴增出來。將與目的片段大小相同的擴增條帶測序后，與目的基因進行核苷酸序列比對，二者核苷酸序列相同，即擴增的與目的片段大小相同的條帶為目的條帶。根據(jù)PCR擴增結(jié)果和核苷酸測序結(jié)果可知，擴增mhp677基因片段的退火溫度范圍為30℃-60℃。圖3.3使用不同的退火溫度擴增豬肺炎支原體mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火溫度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。

第3章豬呼吸系統(tǒng)病原菌單重PCR檢測方法的建立31圖3.2使用不同的退火溫度擴增豬鏈球菌gdh基因片段Fig3.2AmplificationofS.suisgdhgenefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火溫度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。M:DL2000DNAMarker;Annealingtemperaturesinlane1-8:30℃,36℃,42℃,48℃,54℃,60℃,66℃,72℃.3.3.1.3豬肺炎支原體mhp677基因片段退火溫度的確定分別以30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃的退火溫度擴增mhp677基因片段。在退火溫度為30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃時，擴增出一條與目的片段大小相同的526bp的條帶；在退火溫度為66℃和72℃時，沒有條帶擴增出來。將與目的片段大小相同的擴增條帶測序后，與目的基因進行核苷酸序列比對，二者核苷酸序列相同，即擴增的與目的片段大小相同的條帶為目的條帶。根據(jù)PCR擴增結(jié)果和核苷酸測序結(jié)果可知，擴增mhp677基因片段的退火溫度范圍為30℃-60℃。圖3.3使用不同的退火溫度擴增豬肺炎支原體mhp677基因片段Fig3.3AmplificationofM.hyopneumonaiemhp677genefragmentatdifferentannealingtemperatures.M：DL2000DNAMarker；泳道1-8的退火溫度：30℃、36℃、42℃、48℃、54℃、60℃、66℃、72℃。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[3]豬多殺性巴氏桿菌PlpB與Fur基因融合表達及免疫效果評價[D]. 蔣惠婷.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2014
[4]牛源A型多殺性巴氏桿菌plpE基因的克隆表達及DNA疫苗的研究[D]. 黃園媛.西南大學(xué) 2013
[5]豬多殺性巴氏桿菌分離鑒定及其PMT毒素免疫原性研究[D]. 張軍虎.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
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[7]重組多殺性巴氏桿菌細菌幽靈的研究[D]. 劉東勝.南昌大學(xué) 2008
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本文編號：3487789