為體外表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）糖基化囊膜蛋白GP5,以及制備其多克隆抗體,以PRRSV PC疫苗株RNA為模板,應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增GP5基因,并克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-GP5。經(jīng)過酶切和測序鑒定后,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中,加入IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)。使用親和層析法純化PRRSV GP5蛋白。然后將純化的蛋白免疫北京大耳白兔制備多克隆抗體,并進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和間接免疫熒光分析（IFA）。結(jié)果顯示,表達(dá)的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,相對分子質(zhì)量大約30 kDa;制備的GP5蛋白多克隆抗體ELISA效價(jià)可達(dá)1:64 000;IFA檢測顯示,制備的多克隆抗體能夠識(shí)別PRRSV。重組PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗體的成功制備為PRRSV血清學(xué)檢測方法的建立提供了良好的生物學(xué)材料。 

【文章來源】：中國動(dòng)物檢疫. 2020,37(10)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

GP5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

p ET-32a-GP5重組質(zhì)粒雙酶切電泳檢測結(jié)果

利用鎳柱，對菌體裂解產(chǎn)物上清中的GP5蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，含重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a-GP5的菌體在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出了一條約30 k Da的蛋白條帶（圖3），通過純化、濃縮，獲得了GP5蛋白。經(jīng)BCA試劑盒測定該蛋白的終濃度為223.84μg/m L。2.3 GP5蛋白Western Blot檢測

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白的原核可溶性表達(dá)和間接ELISA抗體檢測方法的初步建立[J]. 王俊,代軍飛,馬炳,丁耀忠,歐云文,劉永生,趙樂輝,張永光,張杰.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2018(04)
[2]豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5/M蛋白可溶性表達(dá)及免疫原性分析[J]. 郭玉堃,郭婉瑩,明勝利,郭豫杰,楊國宇.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(04)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5a蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)[J]. 徐彥召,王青,王秋霞,杭柏林,孫亞偉,胡建和.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(03)
[4]PRRSV GP5抗原表位的串聯(lián)表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定[J]. 陳如敬,吳學(xué)敏,車勇良,王隆柏,劉玉濤,嚴(yán)山,魏宏,周倫江.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(06)
[5]施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[J]. 張永寧,吳紹強(qiáng),呂繼洲,馮春燕,王彩霞,袁向芬,鄧俊花,林祥梅,Wernike Kerstin.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(10)
[6]豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白分段表達(dá)及其生物學(xué)功能的鑒定[J]. 劉岳,肖一紅,崔然,劉寧寧,邱洪凱,周恩民.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(04)
[7]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國畜禽傳染病. 1996(02)

碩士論文
[1]兩株豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒全基因組序列比較分析[D]. 王業(yè)華.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]PRRSV GP5蛋白基因疫苗的構(gòu)建及鑒定和三種分子佐劑的制備[D]. 姜丹丹.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]Marc-145細(xì)胞內(nèi)GP5表達(dá)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的影響[D]. 張茂東.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[4]基于母豬PRRS抗體水平確定仔豬疫苗首免日齡的研究[D]. 梁百里.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[5]PRRSV GP5基因亞克隆、原核表達(dá)及ELISA抗體檢測方法的建立[D]. 李建輝.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[6]PRRSV CH-1a株致弱過程中的遺傳變異分析及CH-1R株全長cDNA分子克隆的構(gòu)建[D]. 石文達(dá).東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3483487