為了探索梅花鹿-牛異種體細胞核移植技術，為梅花鹿胚胎工程研究奠定技術基礎，本論文對其供核細胞的培養(yǎng)和冷凍保存、受體卵母細胞的體外成熟、顯微操作、重組胚胎外培養(yǎng)等技術環(huán)節(jié)進行了探索研究，并在水貂、藍狐和貉等毛皮動物上驗證了建立的異種體細胞核移植技術體系。主要內(nèi)容如下：（1）梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞（Ear Skin Fibriblasts，ESF）經(jīng)組織塊法原代培養(yǎng)，利用酶消化時間差與貼壁時間差法處理3～5次純化，結果顯示細胞生長特點為貼壁生長、呈梭形、具偽足，F(xiàn)5代細胞生長曲線呈“潛伏期-對數(shù)生長期-停滯期”的模式。DMSO作為抗凍保護劑時，梅花鹿、水貂、藍狐和貉ESF解凍復蘇后復蘇率分別為89.64%、92.44、91.24和91.04，顯著高于甘油作為抗凍保護劑。結論：梅花鹿、水貂、藍狐和貉ESF具有典型的皮膚成纖維細胞生長特點，通過酶消化時間與貼壁時間差的方法對其純化可行，冷凍保存時可采用10%DMSO作為抗凍保護劑。（2）牛卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）經(jīng)22h體外成熟培養(yǎng)之后，LH+FSH和PMSG+HCG組成... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 梅花鹿的繁殖特點及繁育生物技術
        1.1.1 梅花鹿的繁殖特點
        1.1.2 梅花鹿的繁育生物技術
    1.2 水貂、藍狐及貉的經(jīng)濟價值與繁育生物技術
        1.2.1 水貂的經(jīng)濟價值與繁育生物技術
        1.2.2 藍狐和貉的經(jīng)濟價值與繁育生物技術
    1.3 異種體細胞核移植技術研究進展
        1.3.1 ISCNT 研究歷史
        1.3.2 ISCNT 關鍵技術環(huán)節(jié)
        1.3.3 ISCNT 的研究意義
        1.3.4 ISCNT 研究存在的問題
    1.4 本研究的內(nèi)容、目的及意義
        1.4.1 梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)及冷凍保存
        1.4.2 牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)條件的優(yōu)化
        1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技術方法的研究
        1.4.4 水貂、藍狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制備
第二章 供核細胞培養(yǎng)及冷凍保存
    2.1 材料和方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 試驗設計
        2.1.4 統(tǒng)計分析
    2.2 結果與分析
        2.2.1 梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞的生長特性
        2.2.3 DMSO 和甘油對不同供核細胞的冷凍保護效果
    2.3 討論
        2.3.1 梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)
        2.3.2 梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞的純化
        2.3.3 梅花鹿、水貂、藍狐和貉耳皮膚成纖維細胞的冷凍保存
    2.4 小結
第三章 牛卵母細胞體外成熟體系的優(yōu)化
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
        3.1.3 測定指標與評定方法
        3.1.4 統(tǒng)計分析
    3.2 結果與分析
        3.2.1 不同激素組合對牛卵母細胞體外成熟的影響
        3.2.2 BCB 染色優(yōu)選牛卵母細胞體外成熟
        3.2.3 EGF 對牛卵母細胞體外成熟的影響
    3.3 討論
        3.3.1 激素對牛卵母細胞體外成熟的影響
        3.3.2 BCB 染色對牛卵母細胞體外成熟的作用
        3.3.3 EGF 對牛卵母細胞體外成熟的影響
    3.4 小結
第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技術研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
        4.1.4 統(tǒng)計分析
    4.2 結果與分析
        4.2.1 DEME 誘導牛卵母細胞顯核的研究
        4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 顯微操作的研究
        4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎體外培養(yǎng)的研究
    4.3 討論
        4.3.1 DEME 處理對牛卵母細胞顯核的影響
        4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 顯微操作
        4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎體外培養(yǎng)
    4.4 小結
第五章 水貂、藍狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制備
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
        5.1.3 試驗設計
        5.1.4 統(tǒng)計分析
    5.2 結果與分析
        5.2.1 供核細胞對全細胞胞質(zhì)內(nèi)注射制備 ISCNT 胚胎的影響
        5.2.2 共培養(yǎng)對毛皮動物-牛 ISCNT 胚胎體外發(fā)育的影響
    5.3 討論
        5.3.1 供核細胞對全細胞胞質(zhì)內(nèi)注射制備 ISCNT 胚胎的影響
        5.3.2 共培養(yǎng)對水貂、藍狐及貉-牛 ISCNT 胚胎體外發(fā)育的影響
    5.4 小結
第六章 全文結論
    6.1 結論
    6.2 研究的創(chuàng)新點
    6.3 后續(xù)研究工作
參考文獻
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應[D]. 阿薩（Md.Asaduzzaman Khan）.中南大學 2013

碩士論文
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[2]麋鹿皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)與細胞周期同步化研究[D]. 趙雪萍.南京農(nóng)業(yè)大學 2006
[3]影響綿、山羊體外胚胎生產(chǎn)主要因素的研究[D]. 衛(wèi)恒習.河北農(nóng)業(yè)大學 2005
[4]東北梅花鹿卵巢中卵泡發(fā)育的組織學研究[D]. 鄭丁團.東北林業(yè)大學 2005
[5]鹿卵母細胞體外成熟與體外受精的研究[D]. 崔凱.東北林業(yè)大學 2004
[6]黇鹿和牧羊犬皮膚細胞的分離與培養(yǎng)研究[D]. 王啟鳳.南京農(nóng)業(yè)大學 2003
[7]藍白花肉牛皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件研究[D]. 張琦.西北農(nóng)林科技大學 2003



本文編號：3482053