為了探索梅花鹿-牛異種體細(xì)胞核移植技術(shù)，為梅花鹿胚胎工程研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)，本論文對其供核細(xì)胞的培養(yǎng)和冷凍保存、受體卵母細(xì)胞的體外成熟、顯微操作、重組胚胎外培養(yǎng)等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了探索研究，并在水貂、藍(lán)狐和貉等毛皮動物上驗證了建立的異種體細(xì)胞核移植技術(shù)體系。主要內(nèi)容如下：（1）梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞（Ear Skin Fibriblasts，ESF）經(jīng)組織塊法原代培養(yǎng)，利用酶消化時間差與貼壁時間差法處理3～5次純化，結(jié)果顯示細(xì)胞生長特點為貼壁生長、呈梭形、具偽足，F(xiàn)5代細(xì)胞生長曲線呈“潛伏期-對數(shù)生長期-停滯期”的模式。DMSO作為抗凍保護(hù)劑時，梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉ESF解凍復(fù)蘇后復(fù)蘇率分別為89.64%、92.44、91.24和91.04，顯著高于甘油作為抗凍保護(hù)劑。結(jié)論：梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉ESF具有典型的皮膚成纖維細(xì)胞生長特點，通過酶消化時間與貼壁時間差的方法對其純化可行，冷凍保存時可采用10%DMSO作為抗凍保護(hù)劑。（2）牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）經(jīng)22h體外成熟培養(yǎng)之后，LH+FSH和PMSG+HCG組成... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 梅花鹿的繁殖特點及繁育生物技術(shù)
        1.1.1 梅花鹿的繁殖特點
        1.1.2 梅花鹿的繁育生物技術(shù)
    1.2 水貂、藍(lán)狐及貉的經(jīng)濟(jì)價值與繁育生物技術(shù)
        1.2.1 水貂的經(jīng)濟(jì)價值與繁育生物技術(shù)
        1.2.2 藍(lán)狐和貉的經(jīng)濟(jì)價值與繁育生物技術(shù)
    1.3 異種體細(xì)胞核移植技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 ISCNT 研究歷史
        1.3.2 ISCNT 關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)
        1.3.3 ISCNT 的研究意義
        1.3.4 ISCNT 研究存在的問題
    1.4 本研究的內(nèi)容、目的及意義
        1.4.1 梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及冷凍保存
        1.4.2 牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)條件的優(yōu)化
        1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技術(shù)方法的研究
        1.4.4 水貂、藍(lán)狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制備
第二章 供核細(xì)胞培養(yǎng)及冷凍保存
    2.1 材料和方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 試驗設(shè)計
        2.1.4 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長特性
        2.2.3 DMSO 和甘油對不同供核細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果
    2.3 討論
        2.3.1 梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.2 梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞的純化
        2.3.3 梅花鹿、水貂、藍(lán)狐和貉耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存
    2.4 小結(jié)
第三章 牛卵母細(xì)胞體外成熟體系的優(yōu)化
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
        3.1.3 測定指標(biāo)與評定方法
        3.1.4 統(tǒng)計分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 不同激素組合對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響
        3.2.2 BCB 染色優(yōu)選牛卵母細(xì)胞體外成熟
        3.2.3 EGF 對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響
    3.3 討論
        3.3.1 激素對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響
        3.3.2 BCB 染色對牛卵母細(xì)胞體外成熟的作用
        3.3.3 EGF 對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響
    3.4 小結(jié)
第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技術(shù)研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
        4.1.4 統(tǒng)計分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 DEME 誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核的研究
        4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 顯微操作的研究
        4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎體外培養(yǎng)的研究
    4.3 討論
        4.3.1 DEME 處理對牛卵母細(xì)胞顯核的影響
        4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 顯微操作
        4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎體外培養(yǎng)
    4.4 小結(jié)
第五章 水貂、藍(lán)狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制備
    5.1 材料和方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
        5.1.3 試驗設(shè)計
        5.1.4 統(tǒng)計分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 供核細(xì)胞對全細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)注射制備 ISCNT 胚胎的影響
        5.2.2 共培養(yǎng)對毛皮動物-牛 ISCNT 胚胎體外發(fā)育的影響
    5.3 討論
        5.3.1 供核細(xì)胞對全細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)注射制備 ISCNT 胚胎的影響
        5.3.2 共培養(yǎng)對水貂、藍(lán)狐及貉-牛 ISCNT 胚胎體外發(fā)育的影響
    5.4 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
    6.1 結(jié)論
    6.2 研究的創(chuàng)新點
    6.3 后續(xù)研究工作
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]間情期水貂腔前卵泡卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[J]. 崔凱,梁玉穎,馬澤芳.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2013(08)
[2]牛卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 賈振偉,田見暉,安磊,張家新.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(08)
[3]激素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的影響[J]. 馬紅,付博,仁亮,李忠秋,劉娣.  畜牧與獸醫(yī). 2013(04)
[4]核移植中卵母細(xì)胞激活方法的研究進(jìn)展[J]. 王愛萍.  湖北畜牧獸醫(yī). 2013(04)
[5]不同方法處理供核細(xì)胞對細(xì)胞周期和重構(gòu)胚發(fā)育的影響[J]. 蔡琳琳,阮井玲,王娟,曲立娟,李華,黃英.  生命科學(xué)研究. 2012(02)
[6]發(fā)情期藍(lán)狐卵泡發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 田明宇,崔凱,馬澤芳,梁玉穎,李延鵬,高善頌,牛樹田,王海濤,梁俊文,楊淑慧.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(33)
[7]水貂及其經(jīng)濟(jì)價值[J]. 李艷麗,馮艷忠.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2011(12)
[8]化學(xué)輔助去核法對延邊黃牛卵母細(xì)胞去核率及其重構(gòu)胚發(fā)育率的影響[J]. 王玉涵,朱玉霞,尹多,李鐘淑,方南洙.  江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2011(02)
[9]梅花鹿良種繁育技術(shù)研究[J]. 鞠貴春,王麗麗,張輝.  吉林中醫(yī)藥. 2011(03)
[10]梅花鹿新鮮和冷凍胚胎移植技術(shù)的研究[J]. 王梁,史文清,史建民,朱士恩,劉國世.  中國畜牧雜志. 2010(15)

博士論文
[1]白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)[D]. 阿薩（Md.Asaduzzaman Khan）.中南大學(xué) 2013

碩士論文
[1]PMSG對性成熟前小鼠卵泡發(fā)育的影響及牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)研究[D]. 孫健.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2009
[2]麋鹿皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與細(xì)胞周期同步化研究[D]. 趙雪萍.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[3]影響綿、山羊體外胚胎生產(chǎn)主要因素的研究[D]. 衛(wèi)恒習(xí).河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005
[4]東北梅花鹿卵巢中卵泡發(fā)育的組織學(xué)研究[D]. 鄭丁團(tuán).東北林業(yè)大學(xué) 2005
[5]鹿卵母細(xì)胞體外成熟與體外受精的研究[D]. 崔凱.東北林業(yè)大學(xué) 2004
[6]黇鹿和牧羊犬皮膚細(xì)胞的分離與培養(yǎng)研究[D]. 王啟鳳.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003
[7]藍(lán)白花肉牛皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及培養(yǎng)條件研究[D]. 張琦.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2003



本文編號：3482053