非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一種高致病率和死亡率的急性、烈性、接觸性的傳染病,強毒株感染后導致動物100%的死亡率,而目前針對非洲豬瘟還并沒有有效的疫苗給以預防,該病對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的威脅和經(jīng)濟損失。我國目前雖然尚無非洲豬瘟疫病的發(fā)生,但是隨著日漸頻繁的進出口貿(mào)易發(fā)展,以及人員流動的來往,該病傳入我國的可能性也隨之增大。為了能及時的檢測出非洲豬瘟,預防該病傳入我國,因此建立一種快速高效檢測非洲豬瘟病毒的實驗室診斷方法顯得非常重要,本研究在分子生物學的基礎上,利用環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）快速、簡便的特性,建立了一種快速檢測非洲豬瘟病毒LAMP方法。本試驗根據(jù)NCBI已登錄的非洲豬瘟K205R基因序列,人工合成該基因質(zhì)粒作為試驗所需模板。通過在線軟件,根據(jù)LAMP引物設計原理,針對非洲豬瘟病毒K205R基因序列設計了一套特異性引物,在進行反應條件優(yōu)化后成功建立了非洲豬瘟病毒的LAMP檢測... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 非洲豬瘟概述
        1.1 病原學及其研究進展
            1.1.1 病毒的分類及結構特征
            1.1.2 病毒的理化特性
            1.1.3 病毒的主要蛋白
            1.1.4 病毒的侵入機理
            1.1.5 病毒免疫逃避機制
        1.2 流行病學及其研究進展
            1.2.1 易感動物和傳染源
            1.2.2 地理分布及傳播途徑
        1.3 致病機理
        1.4 臨床癥狀及病理變化
        1.5 實驗室診斷方法
            1.5.1 病毒分離和免疫學檢測
            1.5.2 分子生物學檢測
        1.6 防治措施
    2. 環(huán)介導等溫擴增概述
        2.1 技術特點
        2.2 反應原理
        2.3 引物設計
        2.4 反應體系
        2.5 應用實例
            2.5.1 LAMP技術在細菌方面的應用
            2.5.2 LAMP技術在病毒方面的應用
            2.5.3 LAMP技術在寄生蟲方面的應用
    3. 研究目的與意義
第二章 非洲豬瘟LAMP檢測方法的建立
    1 實驗材料
        1.1 主要儀器
        1.2 實驗主要試劑
        1.3 相關試劑的制備
    2 質(zhì)粒模板的制備
        2.1 非洲豬瘟病毒質(zhì)粒的制備
        2.2 病毒質(zhì)粒濃度測定
        2.3 其他病毒DNA模板的制備
    3 非洲豬瘟病毒檢測方法的建立
        3.1 引物設計與合成
        3.2 酶切位點分析
        3.3 引物的驗證
        3.4 結果判定
        3.5 LAMP產(chǎn)物的鑒定
            3.5.1 LAMP產(chǎn)物酶切鑒定
            3.5.2 LAMP產(chǎn)物克隆測序鑒定
                3.5.2.1 LAMP產(chǎn)物的PCR擴增
                3.5.2.2 PCR擴增片段的凝膠回收
                3.5.2.3 感受態(tài)細胞的制備
                3.5.2.4 重組質(zhì)粒的連接
                3.5.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
                3.5.2.6 測序鑒定
        3.6 LAMP反應條件的優(yōu)化
            3.6.1 反應溫度的優(yōu)化
            3.6.2 反應時間的優(yōu)化
            3.6.3 鎂離子濃度的優(yōu)化
            3.6.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            3.6.5 內(nèi)外引物比例優(yōu)化
            3.6.6 甜菜堿的作用
        3.7 PCR檢測條件的優(yōu)化
        3.8 靈敏度試驗
        3.9 特異性試驗
        3.10 穩(wěn)定性試驗
    4. 結果與分析
        4.1 模板測序以及濃度的測定
        4.2 引物驗證結果
        4.3 反應條件的優(yōu)化
            4.3.1 反應溫度的優(yōu)化
            4.3.2 反應時間的優(yōu)化
            4.3.3 鎂離子濃度的優(yōu)化
            4.3.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            4.3.5 外內(nèi)引物濃度比例的優(yōu)化
            4.3.6 甜菜堿的作用
        4.4 LAMP反應條件的確立
        4.5 非洲豬瘟病毒LAMP可視化檢測
        4.6 LAMP產(chǎn)物的鑒定
            4.6.1 LAMP產(chǎn)物酶切鑒定
            4.6.2 LAMP產(chǎn)物克隆測序鑒定
        4.7 PCR反應條件確立
        4.8 LAMP靈敏性試驗
        4.9 LAMP特異性試驗
        4.10 LAMP穩(wěn)定性試驗
    5. 討論
        5.1 選題的必要性
        5.2 非洲豬瘟病毒質(zhì)粒模板的制備
        5.3 建立本方法的技術優(yōu)勢
        5.4 反應條件對LAMP的影響
            5.4.1 溫度對LAMP反應的影響
            5.4.2 鎂離子對LAMP反應的影響
            5.4.3 引物比例對LAMP反應的影響
            5.4.4 其他因素對LAMP反應的影響
        5.5 假陽性分析及應對
    6 結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3468210