非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一種高致病率和死亡率的急性、烈性、接觸性的傳染病,強(qiáng)毒株感染后導(dǎo)致動物100%的死亡率,而目前針對非洲豬瘟還并沒有有效的疫苗給以預(yù)防,該病對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失。我國目前雖然尚無非洲豬瘟疫病的發(fā)生,但是隨著日漸頻繁的進(jìn)出口貿(mào)易發(fā)展,以及人員流動的來往,該病傳入我國的可能性也隨之增大。為了能及時(shí)的檢測出非洲豬瘟,預(yù)防該病傳入我國,因此建立一種快速高效檢測非洲豬瘟病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法顯得非常重要,本研究在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上,利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）快速、簡便的特性,建立了一種快速檢測非洲豬瘟病毒LAMP方法。本試驗(yàn)根據(jù)NCBI已登錄的非洲豬瘟K205R基因序列,人工合成該基因質(zhì)粒作為試驗(yàn)所需模板。通過在線軟件,根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原理,針對非洲豬瘟病毒K205R基因序列設(shè)計(jì)了一套特異性引物,在進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化后成功建立了非洲豬瘟病毒的LAMP檢測... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 非洲豬瘟概述
        1.1 病原學(xué)及其研究進(jìn)展
            1.1.1 病毒的分類及結(jié)構(gòu)特征
            1.1.2 病毒的理化特性
            1.1.3 病毒的主要蛋白
            1.1.4 病毒的侵入機(jī)理
            1.1.5 病毒免疫逃避機(jī)制
        1.2 流行病學(xué)及其研究進(jìn)展
            1.2.1 易感動物和傳染源
            1.2.2 地理分布及傳播途徑
        1.3 致病機(jī)理
        1.4 臨床癥狀及病理變化
        1.5 實(shí)驗(yàn)室診斷方法
            1.5.1 病毒分離和免疫學(xué)檢測
            1.5.2 分子生物學(xué)檢測
        1.6 防治措施
    2. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增概述
        2.1 技術(shù)特點(diǎn)
        2.2 反應(yīng)原理
        2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.4 反應(yīng)體系
        2.5 應(yīng)用實(shí)例
            2.5.1 LAMP技術(shù)在細(xì)菌方面的應(yīng)用
            2.5.2 LAMP技術(shù)在病毒方面的應(yīng)用
            2.5.3 LAMP技術(shù)在寄生蟲方面的應(yīng)用
    3. 研究目的與意義
第二章 非洲豬瘟LAMP檢測方法的建立
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        1.3 相關(guān)試劑的制備
    2 質(zhì)粒模板的制備
        2.1 非洲豬瘟病毒質(zhì)粒的制備
        2.2 病毒質(zhì)粒濃度測定
        2.3 其他病毒DNA模板的制備
    3 非洲豬瘟病毒檢測方法的建立
        3.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        3.2 酶切位點(diǎn)分析
        3.3 引物的驗(yàn)證
        3.4 結(jié)果判定
        3.5 LAMP產(chǎn)物的鑒定
            3.5.1 LAMP產(chǎn)物酶切鑒定
            3.5.2 LAMP產(chǎn)物克隆測序鑒定
                3.5.2.1 LAMP產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增
                3.5.2.2 PCR擴(kuò)增片段的凝膠回收
                3.5.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
                3.5.2.4 重組質(zhì)粒的連接
                3.5.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
                3.5.2.6 測序鑒定
        3.6 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化
            3.6.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化
            3.6.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
            3.6.3 鎂離子濃度的優(yōu)化
            3.6.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            3.6.5 內(nèi)外引物比例優(yōu)化
            3.6.6 甜菜堿的作用
        3.7 PCR檢測條件的優(yōu)化
        3.8 靈敏度試驗(yàn)
        3.9 特異性試驗(yàn)
        3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)
    4. 結(jié)果與分析
        4.1 模板測序以及濃度的測定
        4.2 引物驗(yàn)證結(jié)果
        4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化
            4.3.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化
            4.3.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
            4.3.3 鎂離子濃度的優(yōu)化
            4.3.4 dNTP濃度的優(yōu)化
            4.3.5 外內(nèi)引物濃度比例的優(yōu)化
            4.3.6 甜菜堿的作用
        4.4 LAMP反應(yīng)條件的確立
        4.5 非洲豬瘟病毒LAMP可視化檢測
        4.6 LAMP產(chǎn)物的鑒定
            4.6.1 LAMP產(chǎn)物酶切鑒定
            4.6.2 LAMP產(chǎn)物克隆測序鑒定
        4.7 PCR反應(yīng)條件確立
        4.8 LAMP靈敏性試驗(yàn)
        4.9 LAMP特異性試驗(yàn)
        4.10 LAMP穩(wěn)定性試驗(yàn)
    5. 討論
        5.1 選題的必要性
        5.2 非洲豬瘟病毒質(zhì)粒模板的制備
        5.3 建立本方法的技術(shù)優(yōu)勢
        5.4 反應(yīng)條件對LAMP的影響
            5.4.1 溫度對LAMP反應(yīng)的影響
            5.4.2 鎂離子對LAMP反應(yīng)的影響
            5.4.3 引物比例對LAMP反應(yīng)的影響
            5.4.4 其他因素對LAMP反應(yīng)的影響
        5.5 假陽性分析及應(yīng)對
    6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2007-2012年非洲豬瘟在高加索和俄羅斯的流行情況[J]. 翁善鋼.  養(yǎng)豬. 2013(03)
[2]非洲豬瘟流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 包靜月,王志亮.  中國動物檢疫. 2013(06)
[3]非洲豬瘟病毒感染機(jī)制和診斷方法的研究進(jìn)展[J]. 李洪利,張維,李慧,王君瑋,曹金山.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(10)
[4]LAMP技術(shù)快速檢測沙門氏菌方法的建立及其應(yīng)用[J]. 田楨干,閻俊,陸曄,王婷,章琪,張勝萍,王傳貴.  中國國境衛(wèi)生檢疫雜志. 2011(05)
[5]LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）的原理及在寄生蟲檢測上的應(yīng)用[J]. 史亞東,趙子方,朱丹,張龍現(xiàn),寧長申,菅復(fù)春.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2011(10)
[6]非洲豬瘟的主要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[J]. 王宏燕,顧貴波.  養(yǎng)豬. 2011(04)
[7]非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用[J]. 楊吉飛,關(guān)貴全,劉志杰,汪月鳳,李有全,馬米玲,劉愛紅,任巧云,茍惠天,杜鵬飛,羅建勛,殷宏.  中國動物傳染病學(xué)報(bào). 2011(04)
[8]應(yīng)用LAMP快速檢測金黃色葡萄球菌的研究[J]. 唐夢君,周生,葛慶聯(lián),張小燕,蒲俊華,高玉時(shí).  現(xiàn)代食品科技. 2011(06)
[9]豬瘟病毒可視化RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 趙明秋,王偉芳,王波,康艷梅,高健潛,陳金頂.  廣東畜牧獸醫(yī)科技. 2011(02)
[10]非洲豬瘟的研究進(jìn)展[J]. 溫肖會,魏文康,黃忠,呂殿紅.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(10)

碩士論文
[1]非洲豬瘟病毒VP73基因和主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及其ELISA檢測方法的建立[D]. 李秋霞.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010
[2]非洲豬瘟病毒K205R基因檢測方法研究[D]. 郭少平.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號：3468210