剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種世界范圍廣泛寄生于人和多種脊椎動物有核細(xì)胞中的機會性致病原蟲。弓形蟲能夠感染人、豬、牛、馬、羊和鹿等動物,導(dǎo)致孕婦或母畜流產(chǎn)、死胎、畸胎和弱智兒,對人類的生命健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的威脅。鑒于弓形蟲的高度感染率及其在人體醫(yī)學(xué)和畜牧醫(yī)學(xué)中的重要性,探究弓形蟲的致病機理和研制安全有效的疫苗顯得極其重要,這也是預(yù)防和控制人類和動物弓形蟲病的重要措施。為此,本研究用RH株弓形蟲速殖子感染293T細(xì)胞,驗證RH株弓形蟲速殖子對293T細(xì)胞NF-kB信號通路的激活與抑制；通過實時熒光定量PCR（real-time PCR）驗證4個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原假定蛋白基因體內(nèi)外表達(dá)的差異；并將其與已經(jīng)驗證過的3個體內(nèi)外誘導(dǎo)抗原功能基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,探索這些重組質(zhì)粒對293T細(xì)胞中NF-kB信號通路的激活與抑制；以弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因JK483877、 JK483898構(gòu)建DNA疫苗,并在BALB/c小鼠中檢測該疫苗的免疫保護(hù)性。（1）弓形蟲速殖子全蟲對293T細(xì)胞的NF-kB信號通路影響收集純化過的RH株弓形蟲速殖子并接種293T細(xì)胞,根據(jù)雙熒光數(shù)值分... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 弓形蟲簡介
        1.1.1 弓形蟲與弓形蟲病的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 弓形蟲的生活史
        1.1.3 與形蟲病的流行及危害
    1.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)
        1.2.1 熒光素酶報告系統(tǒng)實驗原理
        1.2.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.3 NF-κB信號通路研究進(jìn)展
        1.3.1 NF-κB信號通路概述
        1.3.2 NF-κB信號通路的組成
        1.3.3 病原對NF-κB信號通路的影響
        1.3.4 弓形蟲在宿主NF-κB信號通路中的作用
    1.4 弓形蟲疫苗研究進(jìn)展
        1.4.1 弓形蟲疫苗現(xiàn)狀
        1.4.2 弓形蟲疫苗展望
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
    3.2 主要儀器與試劑
        3.2.1 主要儀器
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要溶液的配置
    3.3 試驗方法
        3.3.1 弓形蟲的收集與純化
        3.3.2 速殖子總RNA的提取
        3.3.3 雙鏈cDNA的合成
        3.3.4 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因表達(dá)差異的驗證
        3.3.5 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原真核質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.6 速殖子對NF-κB激活作用及對TNF-α誘導(dǎo)NF-κB活化的抑制作用
        3.3.7 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原重組質(zhì)粒對NF-κB信號通路的激活與抑制
        3.3.8 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原免疫原性的研究
4 結(jié)果與分析
    4.1 收集和純化速殖子
    4.2 速殖子對NF-κB激活作用及對TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制作用
        4.2.1 TNF-α對293T細(xì)胞NF-κB信號通路激活作用最佳時間的確定
        4.2.2 RH株弓形蟲速殖子對293T細(xì)胞NF-κB信號通路的激活作用
        4.2.3 RH株弓形蟲速殖子對TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制作用
    4.3 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原表達(dá)差異的驗證
    4.4 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因真核質(zhì)粒構(gòu)建
        4.4.1 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因ORF的獲得
        4.4.2 目的片段與pMD-19-T載體的連接
        4.4.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.5 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因?qū)?93T細(xì)胞NF-κB信號通路激活與抑制
        4.5.1 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因?qū)?93T細(xì)胞NF-κB信號通路的激活實驗
        4.5.2 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因?qū)?93T細(xì)胞NF-κB信號通路的抑制實驗
    4.6 弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原JK483877、JK483898免疫特性的研究
        4.6.1 重組質(zhì)粒的抗原性實驗
        4.6.2 實驗動物血清抗體的檢測
        4.6.3 淋巴細(xì)胞增殖實驗
        4.6.4 細(xì)胞因子的檢測
        4.6.5 重組質(zhì)粒對BLAB/c小鼠的保護(hù)力實驗
5 討論
    5.1 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因表達(dá)差異的驗證
    5.2 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.1 真核表達(dá)載體的選擇
        5.2.2 轉(zhuǎn)染方法的選擇以及轉(zhuǎn)染效率的提高
    5.3 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因?qū)F-κB信號通路的激活與抑制
    5.4 DNA疫苗
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]microRNA-125b的功能研究[D]. 趙愛華.中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院 2012
[2]ARF對Miz-1抑制p53轉(zhuǎn)錄活性的阻抑作用[D]. 繆琳.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 2010



本文編號：3465107