在哺乳動(dòng)物中,bmp4可以通過BMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells, PGCs）的形成,但其在雞PGCs形成過程中的功能和機(jī)制仍不清晰。構(gòu)建雞bmp4的過表達(dá)及敲除載體,并轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞檢測(cè)活性。通過同源重組技術(shù)構(gòu)建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重組載體,轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)bmp4的表達(dá);根據(jù)bmp4 CDS序列設(shè)計(jì)3個(gè)敲除靶位點(diǎn)（gRNA）,插入PGMLV-GM1構(gòu)建gRNA序列的重組載體bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9載體與bmp4-sgRNA載體共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,T7E1酶切和TA克隆試驗(yàn)檢測(cè)敲除載體活性及敲除效率。擴(kuò)增獲得bmp4 CDS全長(zhǎng)1546 bp,并成功構(gòu)建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP載體,將其轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后有綠色熒光表達(dá)（25.17%±0.007）,RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的細(xì)胞中bmp4顯著上調(diào)（P<0.01）。3個(gè)gRNA重組載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：生物學(xué)雜志. 2020,37(03)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

bmp4 過表達(dá)載體構(gòu)建

為了驗(yàn)證所構(gòu)建的pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP過表達(dá)載體是否能表達(dá)GFP蛋白,用測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,48 h時(shí)觀察到綠色熒光(圖2-A),說明轉(zhuǎn)染成功。收集細(xì)胞提RNA,RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后,bmp4表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載體及空白對(duì)照組(P<0.01),且空載與空白對(duì)照無顯著差異(圖2-B)。以上結(jié)果均說明構(gòu)建的bmp4過表達(dá)載體有活性,可啟動(dòng)bmp4的表達(dá)。2.3 靶向bmp4的sgRNA載體構(gòu)建

bmp4敲除載體體外活性驗(yàn)證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3464213