在哺乳動物中,bmp4可以通過BMP信號通路調(diào)節(jié)原始生殖細胞（Primordial germ cells, PGCs）的形成,但其在雞PGCs形成過程中的功能和機制仍不清晰。構(gòu)建雞bmp4的過表達及敲除載體,并轉(zhuǎn)染DF-1細胞檢測活性。通過同源重組技術(shù)構(gòu)建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重組載體,轉(zhuǎn)染DF-1細胞,RT-qPCR檢測bmp4的表達;根據(jù)bmp4 CDS序列設(shè)計3個敲除靶位點（gRNA）,插入PGMLV-GM1構(gòu)建gRNA序列的重組載體bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9載體與bmp4-sgRNA載體共轉(zhuǎn)染DF-1細胞,T7E1酶切和TA克隆試驗檢測敲除載體活性及敲除效率。擴增獲得bmp4 CDS全長1546 bp,并成功構(gòu)建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP載體,將其轉(zhuǎn)染DF-1細胞后有綠色熒光表達（25.17%±0.007）,RT-qPCR檢測結(jié)果表明,與對照組相比轉(zhuǎn)染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的細胞中bmp4顯著上調(diào)（P<0.01）。3個gRNA重組載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：生物學(xué)雜志. 2020,37(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

bmp4 過表達載體構(gòu)建

為了驗證所構(gòu)建的pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP過表達載體是否能表達GFP蛋白,用測序正確的菌株提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細胞,48 h時觀察到綠色熒光(圖2-A),說明轉(zhuǎn)染成功。收集細胞提RNA,RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染過表達載體后,bmp4表達量顯著高于轉(zhuǎn)染過表達空載體及空白對照組(P<0.01),且空載與空白對照無顯著差異(圖2-B)。以上結(jié)果均說明構(gòu)建的bmp4過表達載體有活性,可啟動bmp4的表達。2.3 靶向bmp4的sgRNA載體構(gòu)建

bmp4敲除載體體外活性驗證

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]Bmp4/Smad信號通路在小鼠原始卵泡發(fā)育中的作用及作用機制[D]. 丁祥云.山東大學(xué) 2013



本文編號：3464213