ε毒素（Etx）是由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一種具有超強毒力的外毒素,屬于β穿孔素家族的成員。Etx是引起家畜發(fā)生梭菌性腸毒血癥的主要致病因子,動物一旦發(fā)病,死亡率幾乎為100%。通過免疫接種產(chǎn)生針對Etx的保護性抗體是防控疾病的有效途徑。本研究在分析Etx三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,通過對其Domain Ⅲ的芳香族氨基酸簇進行定點突變構(gòu)建了一系列Etx突變體,并采用MDCK細胞毒性試驗、鈣離子內(nèi)流試驗、檢測毒素在細胞膜上的結(jié)合與聚合、小鼠致死性試驗等手段對Etx突變體的功能進行鑒定。結(jié)果表明,位于Domain Ⅲ的第71位酪氨酸（Y71）是影響Etx毒力的關(guān)鍵氨基酸,而且第71位氨基酸殘基的側(cè)鏈芳香環(huán)基團是毒素體外殺細胞活性和體內(nèi)致死性的決定因素。為了進一步確定構(gòu)建的減毒突變體作為亞單位疫苗抗原的潛力,我們選擇Etx-Y71 A作為代表性突變體進行動物體內(nèi)安全性和免疫原性研究。Etx-Y71A接種小鼠后的病理學(xué)觀察顯示,小鼠沒有出現(xiàn)任何病理損傷;GFP熒光示蹤試驗也顯示Etx-Y71A喪失了穿越小鼠血腦屏障的能力,表明Etx-Y71A在動物體內(nèi)具有良好的安全性。同源建模和圓二色譜分析均顯示... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１ｓ前毒素單體結(jié)構(gòu)示意圖??

?中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后研究報告???１２〇ｈ??Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｅ??１００－?，??＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｗ??＝５?８０－?＼?＇?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｓ??荃?｜?＼?＼?＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｆ??｜?Ｓ?６０－?＼?＼?＋?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ｇ??５?＾?４０－?＼?＼?Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ??、Ｗ?，，，Ｅｔｘ??〇Ｊ＿，?，?ｒ?．?ｆ—??圖２．４?Ｅｔｘ－Ｙ７１突變體對ＭＤＣＫ細胞的毒性??Ｆｉｇ．?２．４?Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｙ７１?ｍｕｔａｎｔｓ?ｏｆ?ｓ?ｔｏｘｉｎ?ｔｏｗａｒｄｓ?ｔｏ?ＭＤＣＫ?ｃｅｌｌｓ??２．２．５?Ｅｔｘ突變體對ＭＤＣＫ細胞的穿孔效應(yīng)??采用細胞鈣離子內(nèi)流試驗檢測毒素作用細胞后鈣離子濃度的變化，??以確定Ｅｔｘ及其突變體對細胞的穿孔效應(yīng)。將Ｄｏｍａｉｎ?ＩＩＩ芳香族氨基酸突??變體（Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ、Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ、Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ?與?Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ）與?ＭＤＣＫ?細??胞作用，通過熒光信號強度來檢測細胞內(nèi)鈣離子的濃度的變化，結(jié)果如??圖２．５Ａ所示。Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ，Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ與Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ作用細胞后，細胞內(nèi)??的鈣離子濃度明顯增加，其中Ｅｔｘ－Ｙ１６９Ａ與Ｅｔｘ－Ｙ２５４Ａ導(dǎo)致鈣離子升高??的程度與速度與Ｅｔｘ相似，高于Ｅｔｘ－Ｆ９２Ａ，表明這３個突變體均能夠?qū)??致ＭＤＣＫ細胞的穿孔效應(yīng)，其中Ｙ１６９與Ｙ２５４兩個位點的突變對Ｅｔｘ??的穿孔效應(yīng)沒有影響；Ｆ９２的突變則使毒素的穿孔效應(yīng)有所降低；而??Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ作用細胞后，細胞內(nèi)鈣離子濃度并沒有出現(xiàn)明顯的改變，表明??該位點的突變導(dǎo)致毒素喪失對細胞的穿孔

０－?—?１ｍｇＥｔｘ－Ｈ１０６Ｐ?Ｅ?６０－?＾?１?ｍｇ?Ｅｔｘ－Ｈ１Ｇ６Ｐ??１?＋?刪?Ｐ破消?２??Ｓ?４０－?－?－?ＰＢＳ?ｓ?４０－?－?－?ＰＢＳ??Ｏ?ｕ??Ｏ?４）??２０－?ａ?２０－??〇?Ｉ１?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?〇?．?ｒ?ｉ?°?ｉ?＂ｉ??０?８?１６?２４?３２?４０?４８?０?８?１６?２４?３２?４０?４８??Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ?Ｈｏｕｒｓ?ｐｏｓｔ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ??圖２．丨ｌ?Ｅｔｘ－Ｙ７ｌ?Ａ接種羊血清中Ｅｔｘ特異性抗體及其中和活性??Ｆｉｇ?２．１１?Ｅｔｘ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ａｎｄ?ｉｔｓ?ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｉｎ?ｓｅｒａ?ｆｒｏｍ?Ｅｔｘ－Ｙ７１?Ａ?ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ?ｓｈｅｅｐ??２．２．１４減毒突變體Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ對羔羊的被動免疫??為了評價Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ對新生羔羊的被動免疫效果，本研宄將該突變體??接種３頭懷孕母羊（＃３４、＃３７、＃３８），于分挽前６？７周進行接種，并在??首免４周后進行加強免疫，同時將ＰＢＳ接種兩頭相同規(guī)格的懷孕母羊作??為對照（＃３５、＃３６），采用體外中和試驗對免疫羊血清進行毒素中和抗??體的檢測。結(jié)果如圖２．１２所示，經(jīng)兩次Ｅｔｘ－Ｙ７１Ａ免疫后，３只母羊血清??３５??


本文編號：3462267