新疆多浪羊外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及IL-8相關(guān)基因的篩選
發(fā)布時(shí)間：2021-10-22 03:49
本文以多浪羊外周血淋巴細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,采用SMART技術(shù),構(gòu)建了多浪羊外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù),用地高辛標(biāo)記的IL-8探針與構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行核酸雜交篩選,并對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行了初步分析。首先,從多浪羊外周血中分離淋巴細(xì)胞,用Trizol提取多浪羊外周血淋巴細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA,LDPCR擴(kuò)增后獲得雙鏈DNA,采用蛋白酶K和Sfi I消化,產(chǎn)生的接頭和cDNA片段經(jīng)CHROMA SPIN-400柱離心分離,收集400bp以上的cDNA片段,然后將這些外源片段與λTriplEx2 Vector載體連接后轉(zhuǎn)染噬菌體,測(cè)定初始文庫(kù)滴度,之后進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增。結(jié)果表明,構(gòu)建的cDNA文庫(kù)初始滴度為5.6×107pfu/mL,克隆文庫(kù)滴度為1.5×10pfu/mL。由此結(jié)論說(shuō)明所構(gòu)建的多浪羊外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)容量符合文庫(kù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn),該cDNA文庫(kù)可以方便地從中篩選所需的目的基因,更為重要的是可以用于分離全長(zhǎng)基因,為更進(jìn)一步開(kāi)展基因功能研究奠定基礎(chǔ)。以地高辛標(biāo)記的IL-8基因?yàn)樘结?在多浪羊外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中進(jìn)行非特異性篩選免疫應(yīng)答相關(guān)基因,經(jīng)2輪篩選挑取陽(yáng)性克隆菌...
【文章來(lái)源】：塔里木大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)
【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
一多浪羊淋巴細(xì)胞總RNA電泳圖譜
１．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可??見(jiàn)ｄｓＤＮＡ形成彌散條帶在０．１￣４ｋｂ之間，如圖１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??圖１－３多浪羊淋巴細(xì)胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文庫(kù)的滴度的檢測(cè)??取初始文庫(kù)（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包裝蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀釋為??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ過(guò)夜培養(yǎng)后取出平皿，計(jì)數(shù)噬菌斑的數(shù)量，１０－２為５６２個(gè)，??１０－３為６７個(gè)
１．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可??見(jiàn)ｄｓＤＮＡ形成彌散條帶在０．１￣４ｋｂ之間，如圖１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??圖１－３多浪羊淋巴細(xì)胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文庫(kù)的滴度的檢測(cè)??取初始文庫(kù)（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包裝蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀釋為??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ過(guò)夜培養(yǎng)后取出平皿，計(jì)數(shù)噬菌斑的數(shù)量，１０－２為５６２個(gè)，??１０－３為６７個(gè)
本文編號(hào)：3450323
【文章來(lái)源】：塔里木大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)
【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
一多浪羊淋巴細(xì)胞總RNA電泳圖譜
１．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可??見(jiàn)ｄｓＤＮＡ形成彌散條帶在０．１￣４ｋｂ之間，如圖１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??圖１－３多浪羊淋巴細(xì)胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文庫(kù)的滴度的檢測(cè)??取初始文庫(kù)（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包裝蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀釋為??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ過(guò)夜培養(yǎng)后取出平皿，計(jì)數(shù)噬菌斑的數(shù)量，１０－２為５６２個(gè)，??１０－３為６７個(gè)
１．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可??見(jiàn)ｄｓＤＮＡ形成彌散條帶在０．１￣４ｋｂ之間，如圖１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??圖１－３多浪羊淋巴細(xì)胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標(biāo)準(zhǔn)（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文庫(kù)的滴度的檢測(cè)??取初始文庫(kù)（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包裝蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀釋為??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ過(guò)夜培養(yǎng)后取出平皿，計(jì)數(shù)噬菌斑的數(shù)量，１０－２為５６２個(gè)，??１０－３為６７個(gè)
本文編號(hào)：3450323
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