本文以多浪羊外周血淋巴細胞為實驗材料,采用SMART技術(shù),構(gòu)建了多浪羊外周血淋巴細胞的cDNA文庫,用地高辛標記的IL-8探針與構(gòu)建的文庫進行核酸雜交篩選,并對篩選結(jié)果進行了初步分析。首先,從多浪羊外周血中分離淋巴細胞,用Trizol提取多浪羊外周血淋巴細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA,LDPCR擴增后獲得雙鏈DNA,采用蛋白酶K和Sfi I消化,產(chǎn)生的接頭和cDNA片段經(jīng)CHROMA SPIN-400柱離心分離,收集400bp以上的cDNA片段,然后將這些外源片段與λTriplEx2 Vector載體連接后轉(zhuǎn)染噬菌體,測定初始文庫滴度,之后進行文庫擴增。結(jié)果表明,構(gòu)建的cDNA文庫初始滴度為5.6×107pfu/mL,克隆文庫滴度為1.5×10pfu/mL。由此結(jié)論說明所構(gòu)建的多浪羊外周血淋巴細胞cDNA文庫容量符合文庫構(gòu)建的標準,該cDNA文庫可以方便地從中篩選所需的目的基因,更為重要的是可以用于分離全長基因,為更進一步開展基因功能研究奠定基礎(chǔ)。以地高辛標記的IL-8基因為探針,在多浪羊外周血淋巴細胞cDNA文庫中進行非特異性篩選免疫應(yīng)答相關(guān)基因,經(jīng)2輪篩選挑取陽性克隆菌... 

【文章來源】：塔里木大學新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

一多浪羊淋巴細胞總RNA電泳圖譜

１．２．４?ｃＤＮＡ第二鏈合成ＰＣＲ結(jié)果鑒定??ｍＲＮＡ經(jīng)第一鏈合成后再經(jīng)ＰＣＲ合成第二鏈，反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可??見ｄｓＤＮＡ形成彌散條帶在０．１￣４ｋｂ之間，如圖１－３所示。??５０００ｂ＾??４ｎｎｎｖ．＾．＇?■??３０００ｂｐ／??２０００ｂｐ??２００?Ｏｂｐ＾??■ＥｆｌＦ＾Ｗ＝＝ｌ〇〇〇ｂｐ??謂叫??圖１－３多浪羊淋巴細胞ｄｓＤＮＡ電泳圖譜??Ｍｌ：?ＤＮＡ分子量標準（１Ｋｂ）；?Ｍ２：?ＤＮＡ分子量標準（ＤＬ２０００）；泳道１：?ｄｓＤＮＡ??Ｆｉｇｌ－３?Ｄｕｏｌａｎｇ?ｓｈｅｅｐ?ｔｏｔａＪ?ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ?ｄｓＤＮＡ?ｐｏｌｙａｃｒ＞ｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐ－ｈｏｒｅｓｉｓ??Ｍｌ：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ｌ?Ｋｂ）？?Ｍ２：?ＤＮＡ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）？??ｌａｎｅｓ?１：?ｄｓＤＮＡ??１．２．５?ｃＤＮＡ初始文庫的滴度的檢測??取初始文庫（３叫ｃＤＮＡ，２５ｎＬ包裝蛋白，５００ｐＬＳＭ?ｂｕｆｆｅｒ，?２〇ｎＬ氯仿）ｌ＾Ｌ稀釋為??１０－１、１０＿２、１０－３和１０＂４涂板，３７°Ｃ過夜培養(yǎng)后取出平皿，計數(shù)噬菌斑的數(shù)量，１０－２為５６２個，??１０－３為６７個

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本文編號：3450323