發(fā)布時間：2021-10-20 00:51

　　腸致病性大腸桿菌（ E. coil）引起的仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。主要表現(xiàn)為嚴重的腹瀉、脫水,并導致大批仔豬死亡,嚴重影響仔豬的成活率。由于E. coli耐藥菌株的不斷出現(xiàn),導致藥物治療的效果越來越差,因此研制有效預防仔豬大腸桿菌性腹瀉的疫苗對預防該病的發(fā)生具有重要的實際意義。腸致病性E. coli的流行情況復雜,其攜帶的毒力因子在不同的國家或地區(qū)的流行情況不同,即使在同一地區(qū),毒力因子在不同年份的流行情況也有差別。本研究旨在對近年腸致病性E. coli毒力基因分布進行調查,為疫苗抗原基因的選擇提供依據：根據仔豬大腸桿菌性腹瀉的感染特點,探索以減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的可行性。本研究從38個規(guī)�；i場采集了290份糞便樣品,從中分離得到了381株E. coli,對E. coli分離株進行了毒力因子菌毛（K88、K99、987P、F41、F18、F17）、非菌毛黏附因子（AIDA-I, paa, CS31A, eae, saa）,腸毒素（LT-Ⅰ、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1 ）,志賀毒素（Stx1、Stx2、Stx2e）、毒力島（HPI、LEE）、a-溶血素... 

【文章來源】：東北農業(yè)大學黑龍江省 211工程院校

【文章頁數】：181 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 豬源腸致病性E.coli的主要毒力因子
        1.1.1 腸毒素
        1.1.2 黏附因子
        1.1.3 其他毒力因子
    1.2 E.coli同源重組技術
        1.2.1 自殺載體法
        1.2.2 “線性片段”的方法
    1.3 腸致病性E.coli疫苗
        1.3.1 滅活疫苗
        1.3.2 粘附素類疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
    1.4 細菌活載體疫苗
        1.4.1 減毒沙門氏菌疫苗
        1.4.2 重組BCG載體疫苗
        1.4.3 重組乳酸菌載體疫苗
        1.4.4 志賀菌載體疫苗
        1.4.5 李斯特菌載體疫苗
        1.4.6 大腸桿菌載體疫苗
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 PCR引物
        2.1.4 載體
        2.1.5 實驗動物及細胞系
        2.1.6 主要試劑
        2.1.7 ELISA包被抗原
        2.1.8 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 仔豬腹瀉糞便中E.coli的流行病學調查
        2.2.2 E.coli O142的部分生物學特性鑒定
        2.2.3 E.coli O142減毒菌株的構建
        2.2.4 基于λ噬菌體Kil基因的E.coli雙向篩選平臺的構建
        2.2.5 基于紅色熒光蛋白mKate2基因的E.coli雙向篩選平臺的構建
        2.2.6 利用雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-Kil)構建重組菌株ER-A
        2.2.7 利用雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-mKate2)構建重組菌株ER-B
        2.2.8 重組E.coli ER-A及ER-B作為口服疫苗的可行性分析
        2.2.9 重組E.coli ER-A及ER-B對小鼠的免疫學指標測定
        2.2.10 重組E.coli ER-A及ER-B對豬的免疫學指標測定
3 結果
    3.1 流行病學調查結果
        3.1.1 E.coli的分離與鑒定
        3.1.2 E.coli毒力因子的PCR檢測
        3.1.3 腸毒素相關基因的分離情況
        3.1.4 菌毛及非菌毛粘附因子基因的分離情況
        3.1.5 毒力因子的分布及特征
        3.1.6 毒力因子在不同地區(qū)的分布情況
    3.2 E.coli O142的鑒定
        3.2.1 E.coli O142菌株的鑒定
        3.2.2 E.coli O142菌毛的電鏡觀察
        3.2.3 E.coli O142對ZYM-DIEC02細胞的毒性作用
        3.2.4 E.coli O142對乳鼠的毒性
    3.3 減毒E.coli O142：ΔSTa的構建及鑒定
        3.3.1 抗性基因Kan的擴增
        3.3.2 重組載體pSTa中Kan基因的檢測
        3.3.3 減毒E coli O142：ΔSTa的鑒定
        3.3.4 減毒E.coli O142：ΔSTa對ZYM-DIEC02細胞的毒性作用
        3.3.5 減毒E.coli O142：ΔSTa對乳鼠的毒性
    3.4 基于Kil基因的E.coli雙向篩選平臺的構建及鑒定
        3.4.1 噬菌體Kil基因的擴增
        3.4.2 CIts857-PRPL啟動子序列的擴增
        3.4.3 rrnB轉錄終止子基因的擴增
        3.4.4 CIts857-PRPL-Kil-rrnB操縱子的鑒定
        3.4.5 假基因yaiT同源臂的擴增
        3.4.6 pKil-donor載體的鑒定
        3.4.7 雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-Kil)的PCR鑒定
        3.4.8 雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-Kil)的驗證
    3.5 基于mKate2基因的E.coli雙向篩選平臺的構建及驗證
        3.5.1 紅色熒光蛋白mKate2基因的擴增
        3.5.2 CIts857-PRPL-mKate2-rrnB操縱子的鑒定
        3.5.3 pmKate2-Donor載體的鑒定
        3.5.4 雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-mKate2)的PCR鑒定
        3.5.5 雙向篩選平臺O142(yaiT::PRPL-mKate2)的驗證
    3.6 遞呈LT192-STa13嵌合蛋白的重組菌株ER-A的構建及鑒定
        3.6.1 LT192-STa13嵌合類毒素基因的構建及鑒定
        3.6.2 pL-S-Donor載體的鑒定
        3.6.3 重組菌株ER-A的PCR鑒定
        3.6.4 重組E.coli ER-A中LT192-STa13蛋白的Western blot分析
    3.7 遞呈LT192-STb嵌合蛋白的重組菌株ER-B的構建及鑒定
        3.7.1 LT192-STb嵌合類毒素基因的構建及鑒定
        3.7.2 重組打靶載體pL-S-Donor載體的鑒定
        3.7.3 重組菌株ER-B的PCR鑒定
        3.7.4 重組E.coli ER-B中LT192-STb蛋白的Western blot分析
    3.8 E.coli ER-A及ER-B作為口服疫苗遞呈抗原載體的可行性評價
        3.8.1 ER-A及ER-B對ZYM-DIEC02細胞的毒性
        3.8.2 ER-A及ER-B對乳鼠的毒性
        3.8.3 ER-A及ER-B對胃液環(huán)境的耐受性
        3.8.4 ER-A及ER-B對腸液環(huán)境耐受性
        3.8.5 ER-A及ER-B對膽汁的耐受性
        3.8.6 ER-A及ER-B的口服安全性
        3.8.7 ER-A及ER-B的生長曲線
        3.8.8 ER-A及ER-B的電鏡觀察
        3.8.9 ER-A及ER-B的遺傳穩(wěn)定性
        3.8.10 ER-A及ER-B的定植能力
    3.9 重組E.coli ER-A及ER-B對小鼠的口服免疫效果測定
        3.9.1 免疫小鼠特異性抗體IgG測定
        3.9.2 免疫小鼠特異性抗體sIgA測定
        3.9.3 淋巴細胞增殖結果
        3.9.4 Th1和Th2細胞亞類的檢測
        3.9.5 體外中和試驗
        3.9.6 乳鼠體內中和試驗
        3.9.7 乳鼠攻毒保護試驗
    3.10 重組菌株對豬的口服免疫效果測定
        3.10.1 ER-A及ER-B在豬腸道內的定植能力
        3.10.2 免疫豬特異性抗體IgG測定
        3.10.3 免疫豬特異性抗體sIgA測定
        3.10.4 豬淋巴細胞增殖結果
        3.10.5 Th1和Th2細胞亞類的檢測
        3.10.6 體外中和試驗
        3.10.7 乳鼠體內中和試驗
        3.10.8 攻毒保護試驗
4 討論
    4.1 豬源腸致病性E.coli流行情況
        4.1.1 黏附因子分離率及分布特征
        4.1.2 腸毒素和黏附因子之間的關系
        4.1.3 腸毒素基因的流行特點
        4.1.4 耶爾森毒力島的流行特點
    4.2 E.coli雙向篩選平臺的構建
        4.2.1 同源重組方法的選擇
        4.2.2 Kil及mKate2操縱子的優(yōu)勢
        4.2.3 選擇假基因yaiT作為外源序列插入位點的理由
    4.3 ER-A及ER-B作為口服疫苗候選菌株的可行性分析
        4.3.1 口服疫苗對腸致病性E.coli進行免疫防控的優(yōu)勢
        4.3.2 腸致病性E.coli疫苗的設計
        4.3.3 用LT192-STa13和LT192-STb嵌合類毒素作為靶抗原的優(yōu)勢
        4.3.4 ER-A及ER-B的主要生物學特性
    4.4 ER-A和ER-B的免疫效果
    4.5 本研究的局限和不足之處
    4.6 重組細菌活載體疫苗的發(fā)展方向及可能存在的問題
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3445925