腸致病性大腸桿菌（ E. coil）引起的仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹瀉、脫水,并導(dǎo)致大批仔豬死亡,嚴(yán)重影響仔豬的成活率。由于E. coli耐藥菌株的不斷出現(xiàn),導(dǎo)致藥物治療的效果越來越差,因此研制有效預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉的疫苗對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生具有重要的實(shí)際意義。腸致病性E. coli的流行情況復(fù)雜,其攜帶的毒力因子在不同的國家或地區(qū)的流行情況不同,即使在同一地區(qū),毒力因子在不同年份的流行情況也有差別。本研究旨在對(duì)近年腸致病性E. coli毒力基因分布進(jìn)行調(diào)查,為疫苗抗原基因的選擇提供依據(jù)：根據(jù)仔豬大腸桿菌性腹瀉的感染特點(diǎn),探索以減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的可行性。本研究從38個(gè)規(guī)�；i場(chǎng)采集了290份糞便樣品,從中分離得到了381株E. coli,對(duì)E. coli分離株進(jìn)行了毒力因子菌毛（K88、K99、987P、F41、F18、F17）、非菌毛黏附因子（AIDA-I, paa, CS31A, eae, saa）,腸毒素（LT-Ⅰ、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1 ）,志賀毒素（Stx1、Stx2、Stx2e）、毒力島（HPI、LEE）、a-溶血素... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：181 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 豬源腸致病性E.coli的主要毒力因子
        1.1.1 腸毒素
        1.1.2 黏附因子
        1.1.3 其他毒力因子
    1.2 E.coli同源重組技術(shù)
        1.2.1 自殺載體法
        1.2.2 “線性片段”的方法
    1.3 腸致病性E.coli疫苗
        1.3.1 滅活疫苗
        1.3.2 粘附素類疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
    1.4 細(xì)菌活載體疫苗
        1.4.1 減毒沙門氏菌疫苗
        1.4.2 重組BCG載體疫苗
        1.4.3 重組乳酸菌載體疫苗
        1.4.4 志賀菌載體疫苗
        1.4.5 李斯特菌載體疫苗
        1.4.6 大腸桿菌載體疫苗
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 PCR引物
        2.1.4 載體
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系
        2.1.6 主要試劑
        2.1.7 ELISA包被抗原
        2.1.8 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 仔豬腹瀉糞便中E.coli的流行病學(xué)調(diào)查
        2.2.2 E.coli O142的部分生物學(xué)特性鑒定
        2.2.3 E.coli O142減毒菌株的構(gòu)建
        2.2.4 基于λ噬菌體Kil基因的E.coli雙向篩選平臺(tái)的構(gòu)建
        2.2.5 基于紅色熒光蛋白mKate2基因的E.coli雙向篩選平臺(tái)的構(gòu)建
        2.2.6 利用雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-Kil)構(gòu)建重組菌株ER-A
        2.2.7 利用雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-mKate2)構(gòu)建重組菌株ER-B
        2.2.8 重組E.coli ER-A及ER-B作為口服疫苗的可行性分析
        2.2.9 重組E.coli ER-A及ER-B對(duì)小鼠的免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定
        2.2.10 重組E.coli ER-A及ER-B對(duì)豬的免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定
3 結(jié)果
    3.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果
        3.1.1 E.coli的分離與鑒定
        3.1.2 E.coli毒力因子的PCR檢測(cè)
        3.1.3 腸毒素相關(guān)基因的分離情況
        3.1.4 菌毛及非菌毛粘附因子基因的分離情況
        3.1.5 毒力因子的分布及特征
        3.1.6 毒力因子在不同地區(qū)的分布情況
    3.2 E.coli O142的鑒定
        3.2.1 E.coli O142菌株的鑒定
        3.2.2 E.coli O142菌毛的電鏡觀察
        3.2.3 E.coli O142對(duì)ZYM-DIEC02細(xì)胞的毒性作用
        3.2.4 E.coli O142對(duì)乳鼠的毒性
    3.3 減毒E.coli O142：ΔSTa的構(gòu)建及鑒定
        3.3.1 抗性基因Kan的擴(kuò)增
        3.3.2 重組載體pSTa中Kan基因的檢測(cè)
        3.3.3 減毒E coli O142：ΔSTa的鑒定
        3.3.4 減毒E.coli O142：ΔSTa對(duì)ZYM-DIEC02細(xì)胞的毒性作用
        3.3.5 減毒E.coli O142：ΔSTa對(duì)乳鼠的毒性
    3.4 基于Kil基因的E.coli雙向篩選平臺(tái)的構(gòu)建及鑒定
        3.4.1 噬菌體Kil基因的擴(kuò)增
        3.4.2 CIts857-PRPL啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增
        3.4.3 rrnB轉(zhuǎn)錄終止子基因的擴(kuò)增
        3.4.4 CIts857-PRPL-Kil-rrnB操縱子的鑒定
        3.4.5 假基因yaiT同源臂的擴(kuò)增
        3.4.6 pKil-donor載體的鑒定
        3.4.7 雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-Kil)的PCR鑒定
        3.4.8 雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-Kil)的驗(yàn)證
    3.5 基于mKate2基因的E.coli雙向篩選平臺(tái)的構(gòu)建及驗(yàn)證
        3.5.1 紅色熒光蛋白mKate2基因的擴(kuò)增
        3.5.2 CIts857-PRPL-mKate2-rrnB操縱子的鑒定
        3.5.3 pmKate2-Donor載體的鑒定
        3.5.4 雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-mKate2)的PCR鑒定
        3.5.5 雙向篩選平臺(tái)O142(yaiT::PRPL-mKate2)的驗(yàn)證
    3.6 遞呈LT192-STa13嵌合蛋白的重組菌株ER-A的構(gòu)建及鑒定
        3.6.1 LT192-STa13嵌合類毒素基因的構(gòu)建及鑒定
        3.6.2 pL-S-Donor載體的鑒定
        3.6.3 重組菌株ER-A的PCR鑒定
        3.6.4 重組E.coli ER-A中LT192-STa13蛋白的Western blot分析
    3.7 遞呈LT192-STb嵌合蛋白的重組菌株ER-B的構(gòu)建及鑒定
        3.7.1 LT192-STb嵌合類毒素基因的構(gòu)建及鑒定
        3.7.2 重組打靶載體pL-S-Donor載體的鑒定
        3.7.3 重組菌株ER-B的PCR鑒定
        3.7.4 重組E.coli ER-B中LT192-STb蛋白的Western blot分析
    3.8 E.coli ER-A及ER-B作為口服疫苗遞呈抗原載體的可行性評(píng)價(jià)
        3.8.1 ER-A及ER-B對(duì)ZYM-DIEC02細(xì)胞的毒性
        3.8.2 ER-A及ER-B對(duì)乳鼠的毒性
        3.8.3 ER-A及ER-B對(duì)胃液環(huán)境的耐受性
        3.8.4 ER-A及ER-B對(duì)腸液環(huán)境耐受性
        3.8.5 ER-A及ER-B對(duì)膽汁的耐受性
        3.8.6 ER-A及ER-B的口服安全性
        3.8.7 ER-A及ER-B的生長曲線
        3.8.8 ER-A及ER-B的電鏡觀察
        3.8.9 ER-A及ER-B的遺傳穩(wěn)定性
        3.8.10 ER-A及ER-B的定植能力
    3.9 重組E.coli ER-A及ER-B對(duì)小鼠的口服免疫效果測(cè)定
        3.9.1 免疫小鼠特異性抗體IgG測(cè)定
        3.9.2 免疫小鼠特異性抗體sIgA測(cè)定
        3.9.3 淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果
        3.9.4 Th1和Th2細(xì)胞亞類的檢測(cè)
        3.9.5 體外中和試驗(yàn)
        3.9.6 乳鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)
        3.9.7 乳鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)
    3.10 重組菌株對(duì)豬的口服免疫效果測(cè)定
        3.10.1 ER-A及ER-B在豬腸道內(nèi)的定植能力
        3.10.2 免疫豬特異性抗體IgG測(cè)定
        3.10.3 免疫豬特異性抗體sIgA測(cè)定
        3.10.4 豬淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果
        3.10.5 Th1和Th2細(xì)胞亞類的檢測(cè)
        3.10.6 體外中和試驗(yàn)
        3.10.7 乳鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)
        3.10.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn)
4 討論
    4.1 豬源腸致病性E.coli流行情況
        4.1.1 黏附因子分離率及分布特征
        4.1.2 腸毒素和黏附因子之間的關(guān)系
        4.1.3 腸毒素基因的流行特點(diǎn)
        4.1.4 耶爾森毒力島的流行特點(diǎn)
    4.2 E.coli雙向篩選平臺(tái)的構(gòu)建
        4.2.1 同源重組方法的選擇
        4.2.2 Kil及mKate2操縱子的優(yōu)勢(shì)
        4.2.3 選擇假基因yaiT作為外源序列插入位點(diǎn)的理由
    4.3 ER-A及ER-B作為口服疫苗候選菌株的可行性分析
        4.3.1 口服疫苗對(duì)腸致病性E.coli進(jìn)行免疫防控的優(yōu)勢(shì)
        4.3.2 腸致病性E.coli疫苗的設(shè)計(jì)
        4.3.3 用LT192-STa13和LT192-STb嵌合類毒素作為靶抗原的優(yōu)勢(shì)
        4.3.4 ER-A及ER-B的主要生物學(xué)特性
    4.4 ER-A和ER-B的免疫效果
    4.5 本研究的局限和不足之處
    4.6 重組細(xì)菌活載體疫苗的發(fā)展方向及可能存在的問題
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3445925