根據(jù)Gen Bank中綿羊促卵泡激素受體基因（FSHR）的mRNA序列（登錄號(hào):NM₀01009289.1）設(shè)計(jì)引物,反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增蛋白編碼區(qū)（CDs）區(qū),以獲取綿羊FSHR基因可變剪接體,并通過(guò)Western blot驗(yàn)證其在組織中的表達(dá),通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其在卵泡中的表達(dá)位置。結(jié)果表明,在綿羊卵巢中除了全長(zhǎng)的、編碼695個(gè)氨基酸的FSHR表達(dá)產(chǎn)物外,還鑒定到分別編碼694個(gè)、633個(gè)、595個(gè)、582個(gè)和533個(gè)氨基酸的FSHR可變剪接形式的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在卵泡中主要以695（694）、633和595 3種轉(zhuǎn)錄本形式存在。但在顆粒細(xì)胞中綿羊促卵泡激素受體主要以經(jīng)典分子即695個(gè)氨基酸的形式存在。在卵泡發(fā)育過(guò)程中,FSHR蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化:在初級(jí)卵泡中,FSHR主要在卵母細(xì)胞中表達(dá),而不是在單層的顆粒細(xì)胞中表達(dá),在次級(jí)卵泡中,FSHR在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均不表達(dá),到三級(jí)卵泡（有腔卵泡）時(shí),FSHR蛋白質(zhì)在顆粒細(xì)胞中表達(dá)豐富�？梢�(jiàn),綿羊FSHR基因雖然存在可變剪接體的結(jié)構(gòu),但其功能主要取決于經(jīng)典型的695個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)分子,并且對(duì)初級(jí)卵泡的... 

【文章來(lái)源】：江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2017,33(03)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

剝離的綿羊不同直徑卵泡

圖5綿羊不同剪接形式的FSHＲ氨基酸序列比對(duì)Fig．5TheaminoacidsequencesalignmentofdifferentalternativelysplicedovineFSHＲ達(dá)。在顆粒細(xì)胞中，僅有一種大小的FSHＲ陽(yáng)性條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約7．7×104(圖6)，與編碼全長(zhǎng)695氨基酸序列預(yù)測(cè)的分子量(帶信號(hào)肽分子量預(yù)測(cè)為7．823×104，不帶信號(hào)肽的分子量預(yù)測(cè)為7．653×104)最為接近。對(duì)綿羊卵巢進(jìn)行FSHＲ免疫組化定位分析發(fā)現(xiàn):在竇狀卵泡中，F(xiàn)SHＲ的陽(yáng)性信號(hào)集中在壁顆粒細(xì)胞中;在具有單層顆粒細(xì)胞的原始卵泡中，F(xiàn)SHＲ陽(yáng)性信號(hào)則集中卵母細(xì)胞中而634江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2017年第33卷第3期

非顆粒細(xì)胞中;在具有多層顆粒細(xì)胞的次級(jí)卵泡中，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均無(wú)顯著的FSHＲ陽(yáng)性信號(hào)(圖7)。圖6Westernblot分析綿羊不同組織中FSHＲ蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig．6WesternblotanalysisofovineFSHＲproteinexpressionindifferentsheeptissuesOo:卵母細(xì)胞;GC:顆粒細(xì)胞;TC:膜細(xì)胞。圖7綿羊卵巢中FSHＲ蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)表達(dá)(×200)Fig．7ImmunohistochemicalanalysisofFSHＲproteininsheepovary(×200)3討論本研究中，我們鑒定到綿羊卵泡中存在多種具有G蛋白偶聯(lián)受體形式的FSHＲmＲNA可變剪接形式，而蛋白質(zhì)形式的FSHＲ僅有全長(zhǎng)形式的分子存在。在初級(jí)卵泡中FSHＲ基因僅在卵母細(xì)胞中高水平表達(dá)，在三級(jí)卵泡中主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)。本研究所鑒定的可變剪接體均為胞外域部分的選擇性剪接形式。FSHＲ的可變剪接形式在多個(gè)哺乳動(dòng)物物種中被發(fā)現(xiàn)，但剪接形式隨物種不同有所差異。在小鼠中發(fā)現(xiàn)有缺失exon2、exon5、exon6的多種FSHＲ可變剪接形式［16］。在貓顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有缺失exon3的可變剪接形式［17］。在人卵巢中存在缺失exon2、exon6、exon9及exon8的表達(dá)形式［14，18］。在牛卵巢中發(fā)現(xiàn)有exon4、exon5、exon9缺失的表達(dá)形式［15］。我們發(fā)現(xiàn)，綿羊卵巢中存在缺失exon3、exon4、ex-on5、exon6、exon9等外顯子的可變剪接形式的表達(dá)。在可變剪接過(guò)程中，導(dǎo)致僅exon3和exon4交界處的單個(gè)精氨酸(Arg)缺失，比經(jīng)典型的分子缺少1個(gè)氨基酸。目前還不清楚這種剪接類型是否能翻譯成蛋白質(zhì)，以及具有什么生物學(xué)功能。另外，與人、牛等單胎類型哺乳動(dòng)物相似，綿羊中很早就發(fā)現(xiàn)存在exon9缺失類型［19］，這種缺失所對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列恰好是受體信號(hào)特異性反應(yīng)結(jié)構(gòu)域位置［20］。但我們?cè)诼雅蓊w粒細(xì)胞僅鑒?


本文編號(hào)：3442703