單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）為革蘭氏陽(yáng)性胞內(nèi)食源性病原菌，可突破宿主的消化道屏障、血腦屏障和胎盤(pán)屏障，在細(xì)胞內(nèi)存活并增殖。因此，在消化道和宿主細(xì)胞內(nèi)，李斯特菌將面臨各種氧化應(yīng)激。那么，李斯特菌如何在氧化應(yīng)激條件下維持細(xì)胞內(nèi)的二硫鍵穩(wěn)態(tài)的呢？為此，我們對(duì)含有CxxC基序的二硫鍵形成相關(guān)蛋白（Disulfide bond forming protein, Dsb）Lmo1059的功能進(jìn)行了研究。通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，我們成功表達(dá)并純化了Lmo1059蛋白，且為可溶性形式。通過(guò)DTT作為底物的二硫鍵異構(gòu)酶活性分析表明: Lmo1059具有較高的異構(gòu)酶活性，其二硫鍵異構(gòu)酶催化活性的米氏常數(shù)Km為22.94mM。以胰島素為底物的二硫鍵還原酶活性分析表明：Lmo1059基本無(wú)二硫鍵還原酶活性。為了進(jìn)一步研究Lmo1059的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了單增李斯特菌lmo1059突變株。過(guò)氧化氫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)表明：與野生株相比，lmo1059缺失株在體外培養(yǎng)條件下對(duì)H2O2敏感性無(wú)顯著差異，這說(shuō)明Lmo1059蛋白可能并沒(méi)有直接參與H2O2應(yīng)激相關(guān)的蛋白修復(fù)。李... 

【文章來(lái)源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

同源重組敲除基因示意圖

圖 2.質(zhì)粒 pKSV7 圖譜Figure 2. The map of plasmd pKSV7.的酶切和回收拷貝質(zhì)粒，選用BaｍHＩ和HindIII兩個(gè)10 μl（200 ng/μl）2 μl切酶（10 U/μl） 各 0.5 μl20 μl使用 DNA 回收試劑盒回收酶切片段，通 PCR 和 PCR 產(chǎn)物回收m EGDe 基因序列設(shè)計(jì)基因的上下游同表 1 lmo1059 基因敲除引物

30 ℃培養(yǎng) 2 天。挑取單菌落按上述方法進(jìn)行傳代篩選缺失株，基因缺失 PCR 鑒定后備份保存在-80 ℃，40%甘油。.6 回補(bǔ)載體的克隆與基因回補(bǔ)株構(gòu)建.6.1 構(gòu)建基因回補(bǔ)的重組質(zhì)粒質(zhì)粒 pIMK2 和 pIMK4 是用于 Lm 的基因回補(bǔ)載體，pIMK2 是整合型回補(bǔ)而 pIMK4 是誘導(dǎo)型回補(bǔ)載體。圖譜如圖 3(A，B)，選擇酶切位點(diǎn) NcoHI 克隆重組質(zhì)粒，方法流程同上述。根據(jù) lmo1059 的完整編碼框設(shè)計(jì)引表 2 lmo1059 基因回補(bǔ)引物Table 2 Gene complement primer for lmo1059 mutant物bA EGD fwd：TTTCCATGGATATTAGTCAAATTAAAGCAGAbA EGD rev：TCTGGATCCTTATTTAGCTAATTCATCATCAAGTAGCA B

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備及快捷轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 楊坤,鞏振輝,李大偉.  北方園藝. 2010(14)



本文編號(hào)：3439272