X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（zinc finger protein，X-linked，Zfx）是鋅指蛋白家族中的一員，Zfx基因是睪丸決定因子（Testis Determining Factor，TDF）的候選基因。Zfx/Zfy是位于哺乳動(dòng)物X染色體和Y染色體上的一對(duì)等位基因，Zfx基因是含有的鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使鋅指蛋白可以選擇性地結(jié)合特異的靶基因，引導(dǎo)靶基因穿過(guò)核膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，在精子形成過(guò)程中具有一定功能。RNA干擾（RNA interference,RNAi）轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（post transcriptional genesilence, PTGS）現(xiàn)象，是內(nèi)源性或?qū)肴斯ず铣傻男》肿与p鏈RNA特異性降解與其同源的mRNA的過(guò)程，而后形成20²5個(gè)堿基大小的小干擾RNA，在mRNA水平上阻斷體內(nèi)特異性基因表達(dá)的現(xiàn)象。目的：本實(shí)驗(yàn)希望將RNAi技術(shù)與豬的性別控制結(jié)合起來(lái)，人為對(duì)zfx基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，使X精子的發(fā)育和生成受阻或影響X精子的活性和受精能力，從而獲得較高的雄性后代。方法：依照siRNA的設(shè)計(jì)原則，構(gòu)建針對(duì)豬zfx基因的干擾載體，經(jīng)過(guò)... 

【文章來(lái)源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pLL3.7質(zhì)粒的多克隆插入位點(diǎn)Fig2PLL3.7plasmidpolyclonalenzymeloci

iRNA 序列的設(shè)計(jì)驗(yàn)豬 zfx 基因的 mRNA 序列來(lái)自于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因ank，NCBI），基因編碼為 XM-003134981.3。將 zfx 基因的編碼區(qū)提交到 GeneLi//www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp ）、 WIsiRNA SelectionProgr圖 2.pLL3.7 質(zhì)粒的多克隆插入位點(diǎn)Fig 2 PLL3.7 plasmid polyclonal enzyme loci圖 1. RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen 的限制圖譜和克隆位點(diǎn)Fig 1.The Restriction Map and Cloning Site of RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen

內(nèi)其他基因進(jìn)行同源性比對(duì)。3) a、pSIREN 質(zhì)粒載體 siRNA 序列的設(shè)計(jì):在 siRNA 序列正義鏈 5’端加入 BamH I(GATCC)，在 3’端加上 Loop 環(huán)TTCAAGAGA），使寡核苷酸序列能在解鏈后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖 3），再加入正義鏈的向互補(bǔ)序列，加終止信號(hào) 6 個(gè) T，最后加上 EcoR I (CTTAAG)，形成酶切位點(diǎn)(BamH I)+義鏈+loop 環(huán)+反義鏈+終止信號(hào)+酶切位點(diǎn)(EcoR I)的（圖 4）。如此便設(shè)計(jì)好了完整的RNA。pSIREN 質(zhì)粒載體 siRNA 序列的 5’端和 3’端均為酶粘性末端。在設(shè)計(jì) pSIREN 質(zhì)粒的空載體 siRNA 序列時(shí)，選亂序重排的序列，該序列也經(jīng)LAST，與豬的任何基因無(wú)同源性，此后按前面的步驟設(shè)計(jì)完整的寡合苷酸序列。b、e 質(zhì)粒載體 siRNA 序列的設(shè)計(jì):在 siRNA 序列正義鏈 5’端加 T 重建 U6 啟動(dòng)子-1 位的 T,在 3’端加上 Loop 環(huán)TTCAAGAGA），加入反向互補(bǔ)序列，加入 RNApolymerase 的終止信號(hào) 6 個(gè) T，再加 XhoI（CTCGAG）的粘性末端，由此構(gòu)建 shRNA 表達(dá)的插入序列。序列 5’端為 HpaI切酶(GTTAAC)為平末端，3’端為 Xho I 內(nèi)切酶（CTCGAG）為粘性末端。4) 初步篩選出 5 個(gè) shRNA 寡核苷酸序列，均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司進(jìn)行人工合成，并經(jīng) PAGE 純化。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高效抑制小鼠精子zfx基因shRNA分子的篩選[J]. 馬世俊,馬軍德,賈斌,申紅,王緒海,張挺軍,郭玉強(qiáng),蔡國(guó)寶.  石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2013(04)
[2]RNA干擾機(jī)制在治療HIV上的應(yīng)用[J]. 殷實(shí).  醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐. 2010(03)
[3]X、Y精子分離純度評(píng)價(jià)方法的研究進(jìn)展[J]. 郭家明,朱化彬,王棟,張林波,郝海生,杜衛(wèi)華.  遺傳. 2008(09)
[4]流式細(xì)胞儀在豬性別控制中的應(yīng)用初探[J]. 曾有權(quán),陸陽(yáng)清,牛金濤,黎江,藍(lán)海恩,潘天彪,張明,蒙冰,盧克煥.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(18)
[5]ICR小鼠胚胎及生后不同階段睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育[J]. 盧晅,周新華.  武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2004(04)
[6]性別決定機(jī)理與性別鑒定的研究進(jìn)展[J]. 張秀華,吳登俊.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2004(07)
[7]小鼠睪丸精子細(xì)胞的分離與鑒定[J]. 朱培元,黃宇烽,徐建平.  中華男科學(xué). 2002(01)
[8]與性別有關(guān)的鎘元素[J]. 白海湖.  榆林高等�？茖W(xué)校學(xué)報(bào). 1999(02)
[9]奶牛的精液分離及性控試驗(yàn)[J]. 吳偉,陳元明,劉潤(rùn)錚,王光輝,黃美玉,孫姝芬.  內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報(bào). 1998(03)



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