X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（zinc finger protein，X-linked，Zfx）是鋅指蛋白家族中的一員，Zfx基因是睪丸決定因子（Testis Determining Factor，TDF）的候選基因。Zfx/Zfy是位于哺乳動物X染色體和Y染色體上的一對等位基因，Zfx基因是含有的鋅指結構，該結構特點使鋅指蛋白可以選擇性地結合特異的靶基因，引導靶基因穿過核膜，定位于精子細胞核內，在精子形成過程中具有一定功能。RNA干擾（RNA interference,RNAi）轉錄后水平基因沉默（post transcriptional genesilence, PTGS）現象，是內源性或導入人工合成的小分子雙鏈RNA特異性降解與其同源的mRNA的過程，而后形成20²5個堿基大小的小干擾RNA，在mRNA水平上阻斷體內特異性基因表達的現象。目的：本實驗希望將RNAi技術與豬的性別控制結合起來，人為對zfx基因的表達進行干擾，使X精子的發(fā)育和生成受阻或影響X精子的活性和受精能力，從而獲得較高的雄性后代。方法：依照siRNA的設計原則，構建針對豬zfx基因的干擾載體，經過... 

【文章來源】：石河子大學新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pLL3.7質粒的多克隆插入位點Fig2PLL3.7plasmidpolyclonalenzymeloci

iRNA 序列的設計驗豬 zfx 基因的 mRNA 序列來自于美國國立生物技術信息中心基因ank，NCBI），基因編碼為 XM-003134981.3。將 zfx 基因的編碼區(qū)提交到 GeneLi//www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp ）、 WIsiRNA SelectionProgr圖 2.pLL3.7 質粒的多克隆插入位點Fig 2 PLL3.7 plasmid polyclonal enzyme loci圖 1. RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen 的限制圖譜和克隆位點Fig 1.The Restriction Map and Cloning Site of RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen

內其他基因進行同源性比對。3) a、pSIREN 質粒載體 siRNA 序列的設計:在 siRNA 序列正義鏈 5’端加入 BamH I(GATCC)，在 3’端加上 Loop 環(huán)TTCAAGAGA），使寡核苷酸序列能在解鏈后形成發(fā)夾結構（圖 3），再加入正義鏈的向互補序列，加終止信號 6 個 T，最后加上 EcoR I (CTTAAG)，形成酶切位點(BamH I)+義鏈+loop 環(huán)+反義鏈+終止信號+酶切位點(EcoR I)的（圖 4）。如此便設計好了完整的RNA。pSIREN 質粒載體 siRNA 序列的 5’端和 3’端均為酶粘性末端。在設計 pSIREN 質粒的空載體 siRNA 序列時，選亂序重排的序列，該序列也經LAST，與豬的任何基因無同源性，此后按前面的步驟設計完整的寡合苷酸序列。b、e 質粒載體 siRNA 序列的設計:在 siRNA 序列正義鏈 5’端加 T 重建 U6 啟動子-1 位的 T,在 3’端加上 Loop 環(huán)TTCAAGAGA），加入反向互補序列，加入 RNApolymerase 的終止信號 6 個 T，再加 XhoI（CTCGAG）的粘性末端，由此構建 shRNA 表達的插入序列。序列 5’端為 HpaI切酶(GTTAAC)為平末端，3’端為 Xho I 內切酶（CTCGAG）為粘性末端。4) 初步篩選出 5 個 shRNA 寡核苷酸序列，均委托上海生工生物工程技術服務有限司進行人工合成，并經 PAGE 純化。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3438322