TCDCA作為膽汁酸的主要成分,已被證實(shí)可介導(dǎo)多種信號(hào)通路,從而發(fā)揮其抗炎免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究旨在深入探討TCDCA能否與TGR5受體發(fā)生相互作用,繼而參與由TGR5受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究構(gòu)建了TGR5真核表達(dá)載體,并在293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá),在此基礎(chǔ)上,采用免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、western blotting技術(shù),鑒定了TGR5受體在293T細(xì)胞中的表達(dá)。采用熒光顯微鏡觀測(cè)法,檢測(cè)了293T細(xì)胞受體內(nèi)陷;采用ELISA法,測(cè)定了293T細(xì)胞內(nèi)cAMP含量,分析了TCDCA的量效關(guān)系,293T細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示,TGR5真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,并能夠在239T中表達(dá)。TCDCA作用TGR5后,可引起轉(zhuǎn)染TGR5受體的293T細(xì)胞內(nèi)陷反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)cAMP和螢光素酶含量顯著升高（P<0.01）,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性關(guān)系（r2=0.9958）。結(jié)論:TCDCA能夠與TGR5發(fā)生相互結(jié)合。 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 膽汁酸概況
        1.1.1 膽汁酸來(lái)源及分類(lèi)
        1.1.2 膽汁酸生理作用
        1.1.3 膽汁酸受體研究進(jìn)展
        1.1.4 TGR5受體研究概況
    1.2 TCDCA研究概況
        1.2.1 TCDCA的理化性質(zhì)
        1.2.2 TCDCA作用的研究概況
    1.3 真核表達(dá)系統(tǒng)和 293T細(xì)胞
    1.4 本研究的目的和意義
2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 細(xì)胞、組織
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑、藥品
    2.3 試驗(yàn)儀器
3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
4 試驗(yàn)方法
    4.1 TGR5真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        4.1.2 PCMV-EGFP-TGR5真核表達(dá)載體構(gòu)建
        4.1.3 pCMV-TGR5載體構(gòu)建構(gòu)建
    4.2 TGR5受體在細(xì)胞中的表達(dá)及其測(cè)定
        4.2.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.2.2 TGR5在 293T細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        4.2.3 TGR5在 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果的測(cè)定
        4.2.4 TGR5受體表達(dá)定位
        4.2.5 293T細(xì)胞中TGR5基因mRNA表達(dá)量測(cè)定
        4.2.6 293T細(xì)胞中TGR5蛋白表達(dá)
    4.3 TCDCA與TGR5的結(jié)合活性的研究
        4.3.1 TCDCA的量效關(guān)系分析
        4.3.2 TGR5受體內(nèi)陷
        4.3.3 TCDCA對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響
        4.3.4 TCDCA對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶報(bào)告基因含量的影響
5 結(jié)果與討論
    5.1 含TGR5目的片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.1.1 人TGR5基因擴(kuò)增
        5.1.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-TGR5鑒定
        5.1.3 真核表達(dá)載體pCMV-EGFP-TGR5的鑒定
        5.1.4 pCMV-TGR5質(zhì)粒鑒定
    5.2 TGR5受體在細(xì)胞中的表達(dá)及其測(cè)定
        5.2.1 TGR5在 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果的測(cè)定
        5.2.2 TGR5受體定位
        5.2.3 293T細(xì)胞細(xì)胞中TGR5基因mRNA表達(dá)量測(cè)定
        5.2.4 293T細(xì)胞中TGR5蛋白表達(dá)
    5.3 TCDCA與TGR5的結(jié)合活性的研究
        5.3.1 TCDCA的量效關(guān)系分析
        5.3.2 293T細(xì)胞內(nèi)陷的測(cè)定
        5.3.3 細(xì)胞內(nèi)cAMP含量測(cè)定
        5.3.4 熒光素酶報(bào)告基因含量測(cè)定
6 全文討論
    6.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建
    6.2 TCDCA與TGR5相互作用
        6.2.1 受體內(nèi)陷的研究
        6.2.2 TCDCA作用于TGR5后的量效關(guān)系分析
        6.2.3 TCDCA與TGR5結(jié)合后的繼發(fā)反應(yīng)
    6.3 TGR5介導(dǎo)的信號(hào)通路研究
7 全文結(jié)論
8 課題創(chuàng)新之處
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3433690