發(fā)布時(shí)間：2021-10-12 01:54

　　牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）可感染世界范圍內(nèi)的反芻動(dòng)物,每年可造成約20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV主要在淋巴細(xì)胞群中復(fù)制,導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量嚴(yán)重減少,引起免疫抑制,并且淋巴細(xì)胞衰竭程度與BVDV毒株的毒力有關(guān),具有可逆性。已知程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）參與機(jī)體外周免疫耐受和抗原特異性免疫抑制,導(dǎo)致T細(xì)胞耗盡。PD-1在慢性病毒感染的T細(xì)胞上高度表達(dá),并且阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合,能夠恢復(fù)T細(xì)胞功能。然而在BVDV急性感染期間,阻斷PD-1/PD-L1途徑是否可以恢復(fù)淋巴細(xì)胞的水平尚不明確。本研究通過克隆表達(dá)牛PD-1胞外區(qū)蛋白,制備多抗和單克隆抗體,確定抗體阻斷對(duì)BVDV感染PBL細(xì)胞增殖和凋亡的影響。首先,本研究通過PCR技術(shù)克隆牛PD-1胞外區(qū)基因,插入pET-28a原核表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞,SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明,序... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

牛PD-1胞外區(qū)PCR鑒定

使用 PD-1 胞外區(qū)引物 PCR 鑒定及雙酶切鑒定（圖2-2A 和圖 2-2B），鑒定正確后送公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與 GenBank 中公布的牛 PD-1 序列進(jìn)行比對(duì)，同源性 100%。2.3.3 牛 PD-1 胞外區(qū)的生物信息學(xué)分析2.3.3.1 牛 PD-1 胞外區(qū)的序列分析通過 MEGE6 和 Lasergene 進(jìn)行同源性比較（圖 2-3A，圖 2-3 B），可以發(fā)現(xiàn)構(gòu)建 PD-1胞外區(qū)質(zhì)粒與奶牛和瘤牛 PD-1 胞外區(qū)序列同源性達(dá)到 100%，與牦牛、野生牦牛和水牛的同源性為 99.3%、98.9%和 97.7%，與綿羊和山羊的同源性為 93.6%和 91.5%。與人和鼠的序列相比同源性分別為 79%和 71%。448bp448bp圖 2-2：pMD18-T-PD-1 菌液 PCR 鑒定和雙酶切鑒定Fig.2-2: PCR and double enzyme digestion identification of pMD18-T-PD-1 bacterial solution圖 A M：DL2000 標(biāo)準(zhǔn)； 1-3：菌液 PCR 模板Fig.A M: DL 2000 Marker, 1-3: Bacterial fluid PCR圖 B M：DL2000 標(biāo)準(zhǔn)；1-3：pMD18-T-PD-1 重組質(zhì)粒Fig.B M: DL 2000 Marker

圖 2-3：牛 PD-1 胞外區(qū)序列分Fig.2-3: Sequence analysis of the extracellular dom圖 A：PD-1 胞外區(qū)蛋白的同源性分圖 B：PD-1 胞外區(qū)蛋白的進(jìn)化樹分


本文編號(hào)：3431661