發(fā)布時(shí)間：2021-10-09 23:51

　　將布魯氏菌rOmp3148-74-BLS基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中苜一號(hào),最終獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿。本試驗(yàn)利用不依賴于連接反應(yīng)的克�。↙igation-Independent Cloning,LIC）方法將布魯氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表達(dá)載體pJG045上,并利用三親本雜交的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0。最后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿中苜一號(hào)。經(jīng)PCR鑒定,篩選出轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。本試驗(yàn)為今后布魯氏菌轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研發(fā)奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 

【文章來源】：植物研究. 2014,34(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

菌落PCＲ鑒定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ

銹CＲ鑒定，如圖3～4所示，其中兩個(gè)菌落可以擴(kuò)增出500～600bp的條帶，與rOmp3148－74-BLS基因長度相符，說明這兩個(gè)菌落為陽性克攏提取該菌質(zhì)粒，進(jìn)行EcoＲⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定，大片段位于8000～10000bp，小片段位于1000～2000bp;長度與預(yù)期相符。說明rOmp3148－74-BLS基因已經(jīng)成功克隆到載體pJG045。重組質(zhì)粒送至山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與該基因的序列完全一致，證明重組載體pJG-OB構(gòu)建成功。圖3菌落PCＲ鑒定M．DNAMarker;1～7．菌落PCＲFig．3PCＲofcolonyM．DNAMarker;1－7．ColonyPCＲ圖4重組質(zhì)粒的EcoＲⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定M．DNAMarker;1～4．重組質(zhì)粒的EcoＲⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定Fig．4DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠM．DNAMarker;1－4．DigestionwithEcoＲⅠandPstⅠ2．3農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定利用三親本雜交法對(duì)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0，長出的菌落進(jìn)行菌落PCＲ鑒定。如圖5所示，經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出的片段與rOmp3148－74-BLS基因長度相符，說明攜帶rOmp3148－74-BLS基因的質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0。5074期趙亮等:布魯氏菌rOmp3148－74-BLS重組載體的構(gòu)建與苜蓿的轉(zhuǎn)化

圖5農(nóng)桿菌菌落PCＲ鑒定M．DNAMarker:1～8．農(nóng)桿菌菌落PCＲ鑒定Fig．5PCＲofAgrobacteriumcolonyM．DNAMarker;1－8．AgrobacteriumcolonyPCＲ圖6抗潮霉素愈傷組織篩選Fig．6Hygromycin-resistantcallusfilter圖7再生苗與抗性愈傷組織的PCＲ鑒定M．DNAMarker;1．轉(zhuǎn)基因苜蓿再生苗葉片;2．未轉(zhuǎn)基因的苜蓿葉片(陰性對(duì)照);3～6．抗性愈傷組織;7．重組質(zhì)粒PCＲ(陽性對(duì)照)Fig．7PCＲofresistantcallusandregeneratedplantsM．DNAMarker;1．Transgenicleavesofregenerationseedling;2．Untransformedalfalfaleaves(negativecontrol);3－6．Ｒesistantcal-lus;7．Ｒecombinant(positivecontrol)2．4苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定載體pJG045上帶有潮霉素抗性標(biāo)記基因，如圖6所示，將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體接種到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行潮霉素篩選培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織因具有潮霉素抗性，所以生長良好。而圖中箭頭標(biāo)記的未轉(zhuǎn)化的愈傷組織則褐化死亡。經(jīng)組織培養(yǎng)，將最終獲得的苜蓿再生苗與抗性愈傷組織進(jìn)行基因組DNAPCＲ鑒定;如圖7所示，擴(kuò)增產(chǎn)生的片段位于500～750bp，與rOmp3148－74-BLS基因長度相符。最終將其移栽至培養(yǎng)土中，獲得一株苜蓿轉(zhuǎn)基因再生植株(圖8)。圖8苜蓿轉(zhuǎn)基因再生苗Fig．8Transgenicalfalfaseedlings3討論3．1LIC克隆重組效率的提高LIC克隆方法簡便易行，比之于傳統(tǒng)的克隆方法，LIC更適合高通量基因克隆和蛋白質(zhì)表達(dá)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)LIC克隆方法尚存在假陽性率高的問題。針對(duì)這一問題，本試驗(yàn)通過控制載體與目的片段摩爾比的方法，有效地減少了假陽性問題的發(fā)生，最佳摩爾比為目的片段∶載體=5∶1。其次，經(jīng)T4DNA聚合酶處理后的單鏈DNA末端易形成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過控制退火程序降溫速度的方法，適當(dāng)減慢反?


本文編號(hào)：3427228