雞志賀菌病例于2004年由許蘭菊、王川慶等人首次報(bào)道，志賀菌感染雛雞主要表現(xiàn)為膿血痢，能夠引起雛雞死亡。研究顯示志賀菌具有人禽互傳的可能。O-抗原作為細(xì)菌的主要表面抗原，在細(xì)菌進(jìn)化成病原菌的過(guò)程中起重要作用，又由于O-抗原具有豐富的多樣性導(dǎo)致其O-抗原基因簇的保守性很低，因此在DNA水平上研究分子進(jìn)化關(guān)系，尤其在大腸桿菌和志賀菌遺傳進(jìn)化關(guān)系方面，O-抗原基因簇成為最好的研究材料。本研究對(duì)雞鮑氏志賀菌O-抗原基因簇進(jìn)行破譯，旨在從DNA水平上對(duì)雞源志賀菌的起源和進(jìn)化地位進(jìn)行分析。獲得提純O-抗原多糖的方法及初步研究其毒性作用，旨在為從細(xì)菌內(nèi)毒素方面研究雞鮑氏志賀菌的致病作用奠定基礎(chǔ)。具體研究如下：測(cè)定雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因簇序列，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)其基因功能預(yù)測(cè)。采用長(zhǎng)程PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，設(shè)計(jì)6對(duì)相互嵌合引物，克隆測(cè)序，拼接后獲得全基因序列，用生物信息學(xué)方法完成基因注釋并預(yù)測(cè)其功能，對(duì)galF和gnd基因進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果顯示雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因簇序列全長(zhǎng)為12742bp，其與人源鮑氏3型志賀菌和大腸桿菌O167的同源性最高，其核苷酸同源性分別為99.9%和... 

【文章來(lái)源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

細(xì)菌脂多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

原基因簇的全基因序列測(cè)定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個(gè)目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測(cè)序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達(dá)到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計(jì)了 6 對(duì)相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測(cè)序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長(zhǎng) 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)有 4 個(gè)，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細(xì)菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control

原基因簇的全基因序列測(cè)定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個(gè)目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測(cè)序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達(dá)到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計(jì)了 6 對(duì)相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測(cè)序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長(zhǎng) 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)有 4 個(gè)，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細(xì)菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]雞鮑氏志賀氏菌脂多糖的提取方法研究[J]. 潘國(guó)民,許蘭菊,蔣媛媛,李煒,鄧九虎,白毅潔,李欣.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(06)
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[6]改良熱酚水法制備大腸桿菌O157:H7脂多糖抗原的研究[J]. 宋宏新,劉曉陽(yáng),李宏.  食品科學(xué). 2006(10)
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博士論文
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[2]利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對(duì)雞鮑氏志賀菌的鑒定和菌株起源研究[D]. 楊霞.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[3]志賀氏菌和大腸桿菌O抗原基因簇的遺傳進(jìn)化及重要O抗原結(jié)構(gòu)的研究[D]. 楊靜華.南開(kāi)大學(xué) 2004

碩士論文
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[2]人志賀菌對(duì)雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究[D]. 劉紅英.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3415771