雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因進化分析和O-抗原的提純及毒性研究
發(fā)布時間：2021-09-30 11:29
雞志賀菌病例于2004年由許蘭菊、王川慶等人首次報道，志賀菌感染雛雞主要表現(xiàn)為膿血痢，能夠引起雛雞死亡。研究顯示志賀菌具有人禽互傳的可能。O-抗原作為細菌的主要表面抗原，在細菌進化成病原菌的過程中起重要作用，又由于O-抗原具有豐富的多樣性導(dǎo)致其O-抗原基因簇的保守性很低，因此在DNA水平上研究分子進化關(guān)系，尤其在大腸桿菌和志賀菌遺傳進化關(guān)系方面，O-抗原基因簇成為最好的研究材料。本研究對雞鮑氏志賀菌O-抗原基因簇進行破譯，旨在從DNA水平上對雞源志賀菌的起源和進化地位進行分析。獲得提純O-抗原多糖的方法及初步研究其毒性作用，旨在為從細菌內(nèi)毒素方面研究雞鮑氏志賀菌的致病作用奠定基礎(chǔ)。具體研究如下：測定雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因簇序列，進行遺傳進化分析，并對其基因功能預(yù)測。采用長程PCR方法擴增O-抗原基因簇，設(shè)計6對相互嵌合引物，克隆測序，拼接后獲得全基因序列，用生物信息學(xué)方法完成基因注釋并預(yù)測其功能，對galF和gnd基因進行遺傳演化分析。結(jié)果顯示雞源鮑氏志賀菌O-抗原基因簇序列全長為12742bp，其與人源鮑氏3型志賀菌和大腸桿菌O167的同源性最高，其核苷酸同源性分別為99.9%和...
【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省
【文章頁數(shù)】：53 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
細菌脂多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖
原基因簇的全基因序列測定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計了 6 對相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點有 4 個，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control
原基因簇的全基因序列測定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計了 6 對相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點有 4 個，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control
【參考文獻】：
期刊論文
[1]陰外動脈注射脂多糖對奶牛臨床癥狀及白細胞的影響[J]. 胡濤,王加啟,張養(yǎng)東,卜登攀,趙國琦,孫鵬. 中國畜牧獸醫(yī). 2011(06)
[2]雞鮑氏志賀氏菌脂多糖的提取方法研究[J]. 潘國民,許蘭菊,蔣媛媛,李煒,鄧九虎,白毅潔,李欣. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(06)
[3]細菌脂多糖的生物活性及作用機制[J]. 劉中原,李延平. 醫(yī)學(xué)綜述. 2010(02)
[4]細菌類脂A結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J]. 李顏顏,史鋒,李燁,王小元. 微生物學(xué)報. 2008(06)
[5]幼犬志賀氏菌感染的微生物學(xué)診斷[J]. 高鳳山,胡桂學(xué). 安徽農(nóng)學(xué)通報. 2007(03)
[6]改良熱酚水法制備大腸桿菌O157:H7脂多糖抗原的研究[J]. 宋宏新,劉曉陽,李宏. 食品科學(xué). 2006(10)
[7]實驗猴志賀氏菌檢出、血清分型及藥物敏感性試驗[J]. 盤寶進,汪文龍,謝永平,韋梅良,羅兆飛,陳立標(biāo). 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(03)
[8]黑猩猩志賀氏桿菌腸炎的診治[J]. 葉永孟,郭建華,胡澤民,黃澤波. 中國獸醫(yī)雜志. 2006(05)
[9]雞志賀氏菌感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 許蘭菊,王川慶,馬水鋒,薛雙,趙原亮. 中國獸醫(yī)學(xué)報. 2005(06)
[10]腸侵襲性大腸埃希菌O抗原多糖的致病作用[J]. 鐘啟平,陳恩臨,徐建設(shè),董亞利. 中華傳染病雜志. 2005(02)
博士論文
[1]細菌多糖和糖蛋白生物合成途徑及相關(guān)酶類研究[D]. 李磊.山東大學(xué) 2010
[2]利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對雞鮑氏志賀菌的鑒定和菌株起源研究[D]. 楊霞.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[3]志賀氏菌和大腸桿菌O抗原基因簇的遺傳進化及重要O抗原結(jié)構(gòu)的研究[D]. 楊靜華.南開大學(xué) 2004
碩士論文
[1]人源福氏志賀菌對雞腸上皮細胞侵襲特性及其機制研究[D]. 師潤.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]人志賀菌對雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究[D]. 劉紅英.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
本文編號：3415771
【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省
【文章頁數(shù)】：53 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
細菌脂多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖
原基因簇的全基因序列測定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計了 6 對相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點有 4 個，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control
原基因簇的全基因序列測定原基因簇 DNA 用 Sal Ⅰ、Hind Ⅲ 、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ等限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng) 0.8%凝膠電泳顯示如圖 3。根據(jù)酶切結(jié)果選用 EcoR Ⅰ這組酶切產(chǎn)物，連接到 pUC19 載到一個目的片段為 1728 bp 的重組質(zhì)粒，測序后與 GenBank 已公布的志賀菌 O-抗全基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌 O-抗原基因簇的部分序列與人源鮑氏 3 型源最高，達到 99%。因而根據(jù) GenBank 公布的人源 3 型鮑氏志賀菌 O-抗原基因簇序列設(shè)計了 6 對相互嵌合引物，分別克隆入 T 載體中測序，最后相互拼接得到雞賀菌 O-抗原基因簇全基因序列，序列全長 12742 bp，已公布到 GenBank 上，登錄927149。用 Primer Premier 5 分析發(fā)現(xiàn)其 EcoR Ⅰ酶切位點有 4 個，分別位于 3172 bp、8436 bp 及 10150 bp，EcoRⅠ酶切共產(chǎn)生 5 段酶切片段，為別為 5094 bp、3172 bp、1714 bp 及 170 bp，與酶切電泳結(jié)果顯示一致。原基因簇全基因序列分析圖 2 O-抗原基因簇的 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The result of PCR product for O-antigeNote: M: DL15000, 1: PCR product, 2: Negativ圖 1 細菌基因組產(chǎn)物Fig.1 The result of bacterial genomeL15000, 1: Bacterial genome, 2: Negative control
【參考文獻】：
期刊論文
[1]陰外動脈注射脂多糖對奶牛臨床癥狀及白細胞的影響[J]. 胡濤,王加啟,張養(yǎng)東,卜登攀,趙國琦,孫鵬. 中國畜牧獸醫(yī). 2011(06)
[2]雞鮑氏志賀氏菌脂多糖的提取方法研究[J]. 潘國民,許蘭菊,蔣媛媛,李煒,鄧九虎,白毅潔,李欣. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(06)
[3]細菌脂多糖的生物活性及作用機制[J]. 劉中原,李延平. 醫(yī)學(xué)綜述. 2010(02)
[4]細菌類脂A結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J]. 李顏顏,史鋒,李燁,王小元. 微生物學(xué)報. 2008(06)
[5]幼犬志賀氏菌感染的微生物學(xué)診斷[J]. 高鳳山,胡桂學(xué). 安徽農(nóng)學(xué)通報. 2007(03)
[6]改良熱酚水法制備大腸桿菌O157:H7脂多糖抗原的研究[J]. 宋宏新,劉曉陽,李宏. 食品科學(xué). 2006(10)
[7]實驗猴志賀氏菌檢出、血清分型及藥物敏感性試驗[J]. 盤寶進,汪文龍,謝永平,韋梅良,羅兆飛,陳立標(biāo). 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2006(03)
[8]黑猩猩志賀氏桿菌腸炎的診治[J]. 葉永孟,郭建華,胡澤民,黃澤波. 中國獸醫(yī)雜志. 2006(05)
[9]雞志賀氏菌感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 許蘭菊,王川慶,馬水鋒,薛雙,趙原亮. 中國獸醫(yī)學(xué)報. 2005(06)
[10]腸侵襲性大腸埃希菌O抗原多糖的致病作用[J]. 鐘啟平,陳恩臨,徐建設(shè),董亞利. 中華傳染病雜志. 2005(02)
博士論文
[1]細菌多糖和糖蛋白生物合成途徑及相關(guān)酶類研究[D]. 李磊.山東大學(xué) 2010
[2]利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對雞鮑氏志賀菌的鑒定和菌株起源研究[D]. 楊霞.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[3]志賀氏菌和大腸桿菌O抗原基因簇的遺傳進化及重要O抗原結(jié)構(gòu)的研究[D]. 楊靜華.南開大學(xué) 2004
碩士論文
[1]人源福氏志賀菌對雞腸上皮細胞侵襲特性及其機制研究[D]. 師潤.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]人志賀菌對雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究[D]. 劉紅英.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
本文編號：3415771
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