實驗目的用生物信息學方法分析剛地弓形蟲尿苷磷酸化酶（TgUPase）基因編碼蛋白。對TgUPase基因進行克隆、表達，純化重組TgUPase蛋白（rTgUPase）并分析其抗原性。觀察不同劑量rTgUPase滴鼻免疫小鼠誘導的免疫應(yīng)答，探討rTgUPase免疫的適宜劑量。探討rTgUPase作為剛地弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。實驗方法第一部分：綜述了不同生物來源的UPase蛋白的理化性質(zhì)及研究進展。第二部分：對TgUPase基因編碼蛋白進行生物信息的分析，預測其理化性質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)以及潛在的抗原表位。第三部分：收集、純化RH株剛地弓形蟲速殖子，提取總RNA。根據(jù)TgUPase基因開放閱讀框（GenBank: DQ385446.1）設(shè)計引物，引入EcoRI和XhoI酶切位點，RT-PCR擴增編碼TgUPase的基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入原核質(zhì)粒pET30a（+）中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌（E.coli）DH5α，陽性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定；將重組質(zhì)粒pET30a（+）-TgUPase轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）加入IPTG誘導表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學山西省

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TgUPase的二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性及表面可及性Fig.1Thesecondarystructure,hydrophilicity,flexibilityandsurfaceaccessibilityofTgUPase

圖1. pET30a(+)圖譜及插入位點示意圖Fig 1. Map of pET30 and cloning site RT-PCR 引物的設(shè)計與合成根據(jù)剛地弓形蟲 Uridine phosphorylase（TgUPase）基因全長編碼序列的 閱 讀 框 （ GenBank: DQ385446.1 ） 設(shè) 計 引 物 。 上 游 引 物G’GAATTC’ATGTCGGAACTCAAAGGAAG 共 29 個堿基，其中 GAA EcoRI 酶 切 位 點 ， CCG 為 該 酶 的 保 護 堿 基 ； 下 游 引 物GG’CTCGAG’TTACGCCGCAGGCTTGATG 共 29 堿基，其中 CTCGAGoI 酶切位點，CCGG 為該酶的保護堿基。

DL2000；1：陰性對照；2：基因 TgUPase 的圖 1.TgUPase 基因的 RT-PCR 結(jié)果 amplification of UPase gene from Toxoplasma gR（圖 2A）和 EcoRI、XhoI 雙酶切見 1000 bp 左右有一條清晰條帶，質(zhì)粒測序后結(jié)果與已發(fā)表的基因→T，但 AAT 和 AAC 編碼的均為2345M

【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組弓形蟲熱休克蛋白70不同途徑免疫小鼠誘導的小腸黏膜IgA抗體分泌細胞及sIgA抗體的動態(tài)變化[J]. 殷麗天,申金雁,孟曉麗,王海龍,劉紅麗,殷國榮.  中國生物制品學雜志. 2013(02)
[2]乳腺癌相關(guān)基因環(huán)氧化酶2（COX-2）編碼蛋白的主要特性與抗原表位生物信息學分析[J]. 葛曉麗,王芬,殷國榮.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學. 2012(09)
[3]抗原表位鑒定方法的研究進展[J]. 文雪霞,陳化蘭,熊永忠,王秀榮.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(07)
[4]剛地弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2基因片段克隆、表達及抗原性分析[J]. 殷麗天,王芬,孟曉麗,王海龍,劉紅麗,申金雁,殷國榮.  中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志. 2012(02)
[5]剛地弓形蟲棒狀體蛋白17基因的克隆、表達及抗原性分析（英文）[J]. 王海龍,殷麗天,孟曉麗,申金雁,劉紅麗,殷國榮.  中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志. 2012(01)
[6]蘋果過敏原Mal d 4蛋白抗原表位預測及交叉反應(yīng)分析[J]. 夏宏林,何穎,鄒澤紅,陶愛林.  中國免疫學雜志. 2012(01)
[7]弓形蟲復合疫苗滴鼻免疫小鼠誘導腸淋巴細胞變化[J]. 劉成芳,殷國榮,趙瑞君,孔麗.  中國公共衛(wèi)生. 2012(01)
[8]剛地弓形蟲熱休克70基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學分析[J]. 殷麗天,曹蕾,孟曉麗,王海龍,劉紅麗,殷國榮.  中國病原生物學雜志. 2011(07)
[9]重組弓形蟲熱休克蛋白70鼻內(nèi)及皮下免疫小鼠誘導的免疫應(yīng)答比較[J]. 殷麗天,曹蕾,王海龍,孟曉麗,張建紅,殷國榮.  中國生物制品學雜志. 2011(06)
[10]弓形蟲STAg聯(lián)合IFN-γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導不同黏膜部位抗體水平動態(tài)觀察[J]. 劉陽,殷麗天,孟曉麗,王海龍,劉紅麗,殷國榮.  中國病原生物學雜志. 2011(02)

碩士論文
[1]剛地弓形蟲肌動蛋白基因的克隆、表達及重組蛋白的保護性免疫[D]. 郝海霞.山西醫(yī)科大學 2012
[2]剛地弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2基因的生物信息學分析、克隆表達及免疫保護性研究[D]. 王芬.山西醫(yī)科大學 2011
[3]剛地弓形蟲peroxiredoxin基因的克隆、表達、純化及免疫保護性研究[D]. 劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn).山西醫(yī)科大學 2009



本文編號：3415010