弓形蟲�。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）寄生于人和多種動物有核細胞內(nèi)所引起的人獸共患原蟲病,該病廣泛流行于世界各地。弓形蟲不僅對人類健康構成嚴重威脅,還給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失。目前,弓形蟲病的防治主要通過化學治療方法,但其存在副作用大、易復發(fā)、易產(chǎn)生抗藥性以及畜禽產(chǎn)品的藥物殘留等弊端,因此,開展對弓形蟲病流行特點以及弓形蟲疫苗的研究是當前該領域重要方向之一,研制安全、高效的疫苗是預防弓形蟲病首選策略。CDPKs是一類不依賴鈣調(diào)素的蛋白激酶,其可參與調(diào)控寄生蟲的入侵、外出宿主細胞、配子的形成、在宿主體內(nèi)移行等關鍵生理活動,是弓形蟲發(fā)育過程中重要的功能蛋白之一。然而,目前關于該對弓形蟲CDPKs的免疫保護力的研究資料較為匱乏,因此,對其深入研究不僅有助于闡明該抗原作用的免疫機制,同時也為其作為弓形蟲疫苗候選抗原的篩選提供基本依據(jù)。首先,采用RT-PCR技術對弓形蟲RH株速殖子鈣依賴蛋白激酶EF模體（TgCDPKl-EF）基因進行體外擴增、測序,將目的片段的核酸序列及其編碼氨基酸序列與已公布的、在分類上相近的其他原蟲該蛋白的相同區(qū)域進行... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學安徽省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

間接免疫酶化學染色法檢測弓形蟲速殖子TgCDPKI的表達分布

２．１４小鼠免疫及攻蟲后免疫相關因子的ｍＲＮＡ表達水平??采用巧光定量ＰＣＲ相對定量法檢測空白對照組、重組蛋白免疫組、免疫攻蟲組、??空白攻蟲組各采樣點贓臟組織中細胞因子相對于內(nèi)參片－〇如＇Ｍ的表達水平，結果如圖??２－１８所示，與空白對照組相比，用重組蛋白免疫后小鼠脾臟中的介導體液免疫的細胞??因子化Ｗ及介導細胞免疫的細胞因子／／Ｗ－?ｒ的ｍＲＮＡ表達均明顯上調(diào)，Ｈ免后第??７ｄ化在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)９．２倍，／／＝Ｗ－?Ｋ上調(diào)５．７倍，在統(tǒng)計學上達到差異極濕著（Ｐ??＜０．０１）；攻蟲后３ｄ及攻蟲后５ｄ時，化－４在轉(zhuǎn)錄水平上分別上調(diào)１１．５倍和１１倍，而??／仍Ｖ－Ｆ在轉(zhuǎn)錄水平上明顯上調(diào)，分別為空白對照組的５．７倍和５．５倍，均達到達到極??顯著水平（Ｐ＜０．０１）。對未免疫小鼠的攻蟲后相對定量其細胞因子ｍＲＮＡ的表達量發(fā)??現(xiàn)，在攻蟲后第３ｄ時，小鼠的化－４？衷達比空白對照組上調(diào)７．８倍，達到極顯著差異（Ｐ??＜０．０１），而上調(diào)３．３倍，具有顯著差異（Ｐ＜０．０５）。未免疫小鼠攻蟲后第５ｄ??已經(jīng)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，各細胞因子ｍＲＮＡ的表達量與空白對照組比較均顯著降低，結??果達到極思著差異（Ｐ＜化０１）。??對各組小鼠７１知４的ｍＲＮＡ表達量相對定量分析表明，除了處于典型發(fā)病期的??＂空白攻蟲５ｄ＂組的實驗小鼠之外，其余各組的７７：知細民ＮＡ的表達量與空白對照??

２．１０最佳抗原、抗體稀釋度??體外表達融合蛋白純化后稀釋至濃度為ｌＯｆｉｇ／ｍＬ作為包被抗原，采用Ｅｌｉｓａ棋盤??法確定最佳抗原濃度，實驗結果顯示：將抗原釋至２．５｜ｉｇ／ｒｎＬ（ｌ：４），血清稀釋至１：２００??倍時可獲得最大的Ｐ／Ｎ值（即１．８％９／０．１４５８＝１２．７３巧）。??２．１１抗體滴度??重組蛋白經(jīng)佐劑乳化后作為免疫原對小鼠進行Ｈ次免疫后，運用間接ＥＬＩＳＡ法??測定免疫小鼠血清的抗體效價，其ＩｇＧ特異性抗體的平均效價為１：?１４９３３。??２．口黃光定量ＰＣ民反應體系與條件優(yōu)化??針對不各基因的ｃＤＮＡ濃度，出現(xiàn)最小的ＣＴ值、最大英光值Ｗ及在溶解曲線??中不出現(xiàn)非特異峰為指標，分別對退火溫度及引物濃度進行優(yōu)化。分別獲得ＩＸ欠４、??化及７Ｆ７Ｖ－?ｒ相對于內(nèi)參基因口如’Ｍ的最佳反應體系與反應條件。??秦２－２知￡７如＂及化的最佳反應體系與條件??

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3409899