H3N2犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）是一種由禽流感病毒跨宿主傳染至犬,可在犬間迅速傳播的傳染性呼吸道病毒,在亞洲多國以及美國的犬中廣泛流行,易伴隨繼發(fā)性感染,對犬的健康造成極大危害。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)兩株在鼠上復(fù)制能力完全不同的毒株:一株禽源H3N2 CIV（A/canine/Zhejiang/01/2012）（簡稱為ZJ01）,鼠上復(fù)制良好,但無法感染禽;一株H3N2禽流感病毒（A/chicken/Shanghai/D6/2012）（簡稱為SHD6）,不感染小鼠。ZJ01-PB2被SHD6-PB2替換后,ZJ01病毒無法成功拯救;反之,將ZJ01-PB2替換到SHD6毒株之后,SHD6在鼠上復(fù)制能力從不感染變?yōu)閺?fù)制良好。本研究重點(diǎn)闡明PB2對ZJ01病毒在哺乳動物中的適應(yīng)性及作用機(jī)制。分別以ZJ01和SHD6為背景,通過聚合酶活性實(shí)驗(yàn)測定單、雙基因替換后的聚合酶活性,結(jié)果顯示,ZJ01-PB2是影響ZJ01病毒株聚合酶活性的關(guān)鍵基因。通過替換PB2基因的五個功能區(qū)測定聚合酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZJ01 PB2蛋白的627-domain對聚合酶活性具有... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

目的片段擴(kuò)增Fig.2-1Amplificationofthetargetfragment

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章H3N2犬流感病毒PB2基因576氨基酸位點(diǎn)對聚合酶活性有重要影響16圖2-2單基因和雙基因替換檢測聚合酶活性結(jié)果Fig.2-2resultsofsinglegeneanddoublegenesubstitutionfordetectionofpolymeraseactivityA:以ZJ01為背景單基因替換B:以SHD6為背景單基因替換C:以ZJ01為背景雙基因替換D:以SHD6為背景雙基因替換2.3.3關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的篩選對比ZJ01和SHD6毒株的PB2基因，共有18個氨基酸位點(diǎn)不同。將PB2通過功能區(qū)劃分為五個區(qū)域：PB2基因N端區(qū)域、Mid區(qū)域、帽子結(jié)合區(qū)域(Cap-binding)、Linker區(qū)域、627功能區(qū)(627-Domain)。每個區(qū)域都包含ZJ01與SHD6毒株不同的氨基酸位點(diǎn)，其結(jié)果如下圖所示(圖2-3)。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章H3N2犬流感病毒PB2基因576氨基酸位點(diǎn)對聚合酶活性有重要影響17圖2-3氨基酸位點(diǎn)的篩選Fig.2-3Screeningofaminoacidsites2.3.4不同區(qū)域以及氨基酸位點(diǎn)影響聚合酶活性的結(jié)果構(gòu)建了不同區(qū)域突變的PB2基因，通過聚合酶活性實(shí)驗(yàn)測定不同區(qū)域突變對聚合酶活性的影響。其結(jié)果如下圖所示(圖2.4)。根據(jù)以下結(jié)果可知，627-domain突變后使ZJ01聚合酶活性顯著降低260倍(****P＜0.0001)。以SHD6為背景，PB2的627-domain使得SHD6的聚合酶活性顯著增高380倍(****P＜0.0001)；PB2基因的627-domain區(qū)域中共包含4個ZJ01和SHD6不同的氨基酸位點(diǎn)，通過單點(diǎn)突變，測定不同點(diǎn)突變對聚合酶活性的影響。其結(jié)果如下圖所示(圖2-4)，當(dāng)PB2基因的576氨基酸從谷氨酸(E)突變?yōu)橘嚢彼?K)時，使得ZJ01的聚合酶活性顯著降低90倍(****P＜0.0001)。當(dāng)SHD6的PB2基因的576氨基酸位點(diǎn)從賴氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)之后，使得SHD6的聚合酶活性顯著增高240倍(***P＜0.0002)(圖2-4)。圖2-4627-domain對聚合酶活性的影響Fig.2-4627-domainEffectonpolymeraseactivityA:以ZJ01為背景區(qū)域替換聚合酶活性B:以ZJ01為背景單點(diǎn)突變聚合酶活性C:以SHD6為背景單點(diǎn)突變聚合酶活性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]The D253N Mutation in the Polymerase Basic 2 Gene in Avian Influenza（H9N2） Virus Contributes to the Pathogenesis of the Virus in Mammalian Hosts[J]. Jinfeng Zhang,Rong Su,Xiaoyun Jian,Hongliang An,Ronbing Jiang,Chris Ka Pun Mok.  Virologica Sinica. 2018(06)



本文編號：3406304