發(fā)布時間：2021-09-16 20:16

　　鴨病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis, DVH）是由小RNA病毒DHV（Duck Hepatitis Virus）引起的一種以雛鴨肝炎和出血為主要病變的傳染性極強的疾病。VP0、VP1作為DHV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,有很好的免疫原性。通過對VP0、VP1基因截短,篩選出親水性強的優(yōu)勢抗原區(qū)并進(jìn)行表達(dá),制備了VP0、VP1截短基因的多克隆抗體（PcAb）,建立了檢測鴨甲型病毒性肝炎抗原抗體的快速檢測方法。1.VP0、VP1截短基因的表達(dá)以VP0、VP1基因為模板,經(jīng)PCR擴增得到VP0F1、VP0F2、VP0F3、VP1F1、 VP1F2共5段序列,將VPOF1-3, VP1F1-2各自拼接得到VP0、VP1截短基因。將VP0、VP1截短基因克隆到表達(dá)載體pET28a,構(gòu)建pET28a-VP0/VP1（截短）重組質(zhì)粒,在16℃C過夜條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得VP0、VP1截短蛋白并進(jìn)行純化。結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE及western blot分析,證明VP0、VP1截短蛋白純化效果良好,免疫原性強。2.鴨甲型病毒性肝炎抗體間接ELISA檢測方法的建立以純化的VP0截短蛋白為包被抗原... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
文獻(xiàn)綜述
    1 DVH概述
        1.1 DHAV的流行及分布
        1.2 DHAV的分類地位
        1.3 DHAV病原學(xué)特性
        1.4 DHAV分子生物學(xué)特性
        1.5 DHAV診斷方法的研究
        1.6 截短基因的表達(dá)
    2 研究目的與意義
材料方法
    1 試驗材料
        1.1 毒株、動物、質(zhì)粒和血清
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配置
            1.4.1 抗生素
            1.4.2 培養(yǎng)基類
            1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液
            1.4.4 Western blot相關(guān)溶液
            1.4.5 蛋白表達(dá)與檢測的相關(guān)溶液
            1.4.6 純化蛋白相關(guān)溶液
            1.4.7 純化抗體相關(guān)溶液
            1.4.8 ELISA相關(guān)溶液
    2 方法
        2.1 鴨甲型肝炎病毒的增殖與純化
        2.2 VP0、VP1蛋白的分段設(shè)計與引物合成
        2.3 VP0、VP1截短基因的克隆
            2.3.1 病毒RNA的提取
            2.3.2 RT-PCR擴增及檢測
            2.3.3 RT-PCR產(chǎn)物回收與純化
            2.3.4 VP0F1-3、VP1F1-2五段截短基因的回收與純化
            2.3.5 VP0、VP1截短基因與克隆載體的連接
            2.3.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.7 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.4.1 帶有粘性末端VP0、VP1截短基因片段和載體pET28a的制備
            2.4.2 VP0、VP1截短基因和載體pET28a的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定
            2.4.3 重組質(zhì)粒pET28a-VP0/VP1(截短)質(zhì)粒的酶切鑒定
            2.4.4 重組質(zhì)粒pET28a-VP0/VP1(截短)質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的純化
            2.5.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.5.2 截短蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件的摸索
            2.5.3 重組蛋白的可溶性分析
            2.5.4 重組蛋白的純化
            2.5.5 重組蛋白濃度的測定
            2.5.6 重組蛋白Western blot檢測
        2.6 間接ELISA檢測方法的建立
            2.6.1 間接ELISA檢測方法的操作步驟
            2.6.2 重組蛋白最佳包被濃度和最佳血清工作濃度的確定
            2.6.3 最佳包被條件的確定
            2.6.4 最佳封閉劑和封閉時間的確定
            2.6.5 血清最佳作用時間的確定
            2.6.6 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和最佳作用時間的確定
            2.6.7 最佳顯色時間的確定
            2.6.8 陰陽性臨界值的確定
            2.6.9 特異性試驗
            2.6.10 敏感性試驗
            2.6.11 重復(fù)性試驗
            2.6.12 包被抗原保存期試驗
        2.7 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體的制備
            2.7.1 日本大耳白兔的免疫
            2.7.2 抗血清的收集
            2.7.3 間接ELISA法檢測抗體血清效價
            2.7.4 多克隆抗體的純化
            2.7.5 多克隆抗體濃度的測定
        2.8 夾心ELISA檢測方法的建立
            2.8.1 夾心ELISA方法的操作程序
            2.8.2 捕獲抗體的選擇
            2.8.3 最佳封閉劑和封閉時間的確定
            2.8.4 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的確定
            2.8.5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定
            2.8.6 最佳抗原、鴨多抗和酶標(biāo)二抗最佳作用時間的確定
            2.8.7 最佳顯色時間的確定
            2.8.8 陰陽性臨界值的確定
            2.8.9 特異性試驗
            2.8.10 重復(fù)性試驗
試驗結(jié)果
    1 鴨甲型肝炎病毒(DHAV-I)的濃度測定
    2 VP0、VP1截短基因的克隆表達(dá)
        2.1 VP0、VP1基因RT-PCR的擴增結(jié)果
        2.2 VPOF1-3、VP1F1-2基因和VP0、VP1截短基因擴增結(jié)果
        2.3 pET28a-VP0/VP1(截短)重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        2.4 截短蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件的摸索及表達(dá)形式的鑒定
        2.5 可溶性截短蛋白的純化及濃度的測定
        2.6 截短蛋白的Western blot結(jié)果
    3 鴨肝炎病毒VP0截短蛋白間接ELISA檢測方法的建立
        3.1 VP0截短蛋白最佳包被濃度和鴨血清稀釋度的確定
        3.2 最佳包被條件的確定
        3.3 最佳封閉劑和封閉時間的確定
        3.4 血清最佳作用時間的確定
        3.5 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度和最佳作用時間的確定
        3.6 最佳顯色時間的確定
        3.7 陰陽性臨界值的確定
        3.8 特異性試驗
        3.9 敏感性試驗
        3.10 重復(fù)性試驗
        3.11 包被抗原保存期試驗
    4 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體的制備
        4.1 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體效價的測定
        4.2 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體濃度的測定
    5 夾心ELISA檢測方法的建立
        5.1 捕獲抗體的確定
        5.2 最佳封閉劑和封閉時間的確定
        5.3 捕獲抗體和檢測抗體最佳濃度的確定
        5.4 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定
        5.5 最佳抗原、鴨多抗和酶標(biāo)二抗最佳作用時間的確定
        5.6 最佳顯色時間的確定
        5.7 陰陽性臨界值的確定
        5.8 特異性試驗
        5.9 重復(fù)性試驗
討論
    1 VP0、VP1的截短表達(dá)
    2 VP0、VP1截短蛋白的分析
    3 間接ELISA檢測方法
    4 夾心ELISA檢測方法
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴨病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR診斷方法的建立及應(yīng)用[J]. 郝明飛,張秀美,胡北俠,張琳,許傳田,楊少華,李建亮,陳正濤,崔言順.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2012(08)
[2]新型鴨肝炎病毒的分離鑒定及VP1基因序列分析[J]. 趙金花,沈志強,朱輝,李峰,甄洪花,苗立中,單虎.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2011(10)
[3]新型鴨肝炎病毒的分離鑒定[J]. 范書才,李虹,袁率珍,巢偉,王少英,林旭野,張毓金,朱山林,張兵,姜畔,范小舟.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2009(10)
[4]鴨肝炎病毒基因的生物信息學(xué)分析及多聚蛋白的加工預(yù)測[J]. 聶奎,胡燕賓,曾興艷,周作勇.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2009(06)
[5]鴨病毒性肝炎病毒VP1基因表達(dá)及其抗體檢測ELISA方法的建立[J]. 馬秀麗,宋敏訓(xùn),于可響,廖明,辛朝安.  微生物學(xué)報. 2008(08)
[6]Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J]. 馬秀麗,宋敏訓(xùn),黃兵,廖明,辛朝安.  家禽科學(xué). 2006(11)
[7]Ⅱ型鴨肝炎病毒變異株的鑒定[J]. 鄭獻(xiàn)進(jìn),張大丙,曲豐發(fā),丁春宇.  中國獸醫(yī)雜志. 2006(05)
[8]鴨病毒性肝炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 趙瑞宏,張小飛,魏建忠,潘孝成.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2006(04)
[9]鴨肝炎病毒單克隆抗體的研制[J]. 楊萍萍,宋敏訓(xùn),艾武,馬秀麗,崔言順.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2006(02)
[10]大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 戎晶晶,刁振宇,周國華.  藥物生物技術(shù). 2005(06)

碩士論文
[1]Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)的鑒定及間接ELISA方法的建立[D]. 張蕾.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]Ⅰ型與新Ⅰ型鴨肝炎病毒分離鑒定及實時熒光定量RT-PCR方法的建立[D]. 陳玉環(huán).東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[3]一種用于A型鴨甲肝病毒檢測的類病毒顆粒制備[D]. 秦沖.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[4]禽白血病抗原和抗體ELISA檢測方法的建立[D]. 謝華麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[5]J亞群禽白血病病毒gp85基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用[D]. 劉麗娜.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[6]Ⅰ型鴨肝炎病毒vp3截短基因的表達(dá)及應(yīng)用[D]. 羅玄.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[7]1型鴨肝炎病毒VP0基因表達(dá)及重組蛋白ELISA方法的建立[D]. 陳敏.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[8]DHV-Ⅰ抗體乳膠凝集試劑盒的研制和間接ELISA方法的建立[D]. 彭婉芬.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[9]1型鴨肝炎病毒JX株基因組序列分析及VP0、VP1基因的原核表達(dá)[D]. 張瑋.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[10]鴨肝炎病毒的分離鑒定及ELISA檢測抗原、抗體方法的建立[D]. 韓永俊.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號：3397224