豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起一種急性、高度傳染的病毒性傳染病，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。2006年，我國出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV），加大了對養(yǎng)豬業(yè)的危害。目前，病毒仍在持續(xù)的進化，在世界范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注。PRRSV難以控制的原因之一在于病毒的致病和免疫機理并不十分清楚，因此，難以研發(fā)安全、有效的疫苗來對該病進行防控。病毒侵入機體后，機體對侵入的病毒產(chǎn)生一定的限制和清除作用。病毒如何調(diào)控細胞內(nèi)相關(guān)信號通路或利用自身編碼蛋白來逃避機體免疫系統(tǒng)的識別和清除，從而有利于自身的感染和復制，成為近年來針對PRRSV研究的熱點。PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，多種病毒感染過程中均能夠活化該通路來有利于自身的復制和增殖。SAMHD1作為最新發(fā)現(xiàn)的天然免疫限制性因子，具有三磷酸水解酶的活性，能夠降解細胞內(nèi)d... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒概述
    1.2 PRRSV 的基因組結(jié)構(gòu)與復制機制
        1.2.1 PRRSV 的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PRRSV 的復制機制
    1.3 PRRSV 編碼蛋白
        1.3.1 PRRSV 的非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.3.2 PRRSV 的結(jié)構(gòu)蛋白
    1.4 PRRSV 感染與先天性免疫
        1.4.1 Toll 樣受體信號
        1.4.2 RIG-I 樣受體信號
        1.4.3 JAK-STAT 信號通路
        1.4.4 PRRSV 感染對天性免疫的調(diào)控
    1.5 PI3K/Akt 信號通路
        1.5.1 PI3K 結(jié)構(gòu)及其生物學功能
        1.5.2 Akt 通路及其生物學功能
        1.5.3 PI3K/Akt 通路與 PRRSV 感染
    1.6 天然免疫限制性因子 SAMHD1 與病毒感染
        1.6.1 SAMHD1 的結(jié)構(gòu)與功能
        1.6.2 SAMHD1 與病毒感染
    1.7 本研究目的和意義
第二章 PRRSV 感染調(diào)控 PI3K/Akt 信號通路的研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和細胞
        2.1.2 抗體和試劑
        2.1.3 病毒滅活
        2.1.4 病毒感染和抑制劑處理
        2.1.5 抑制劑細胞毒性實驗
        2.1.6 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制劑突變株的篩選
        2.1.7 細胞裂解和 Western blot 分析
        2.1.8 總 RNA 的提取與 cDNA 的合成
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 HuN4 感染活化 Akt 信號通路
        2.2.2 LY294002 和 GSK-3 inhibitor X 對細胞活性的影響
        2.2.3 HuN4 感染 MARC-145 細胞導致 Akt 磷酸化上調(diào)受 PI3K 調(diào)控
        2.2.4 滅活病毒誘導 PAM 細胞 Akt 早期磷酸化
        2.2.5 HP-PRRSV 感染調(diào)控 Akt 下游分子 FoxO1、Bad 促進自身增殖
        2.2.6 抑制 Akt 的磷酸化影響細胞病變（CPE）的形成
        2.2.7 Akt 下游分子 GSK-3 的活性與 HuN4 的增殖相關(guān)
        2.2.8 HuN4-F112 株 GSK-3 抑制劑突變株的篩選
    2.3 討論
第三章 豬 SAMHD1 基因序列擴增及單克隆抗體的制備
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細胞與樣品
        3.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        3.1.3 總 RNA 的提取與 cDNA 的合成
        3.1.4 豬 SAMHD1 全基因序列擴增
        3.1.5 豬 SAMHD1 蛋白原核表達與純化
    3.2 豬 SAMHD1 蛋白單克隆抗體的制備
        3.2.1 小鼠免疫
        3.2.2 單克隆抗體的制備
        3.2.3 單克隆抗體效價與特異性鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 SAMHD1 全基因序列擴增
        3.3.2 豬 SAMHD1 原核表達載體的構(gòu)建
        3.3.3 重組豬 SAMHD1 表達、純化與鑒定
        3.3.4 豬 SAMHD1 單克隆抗體的制備、效價測定與特異性鑒定
        3.3.5 IFA 檢測內(nèi)源性豬 SAMHD1 表達
    3.4 討論
第四章 豬 SAMHD1 組織細胞定位及抗病毒作用的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 細胞與病毒
        4.1.2 質(zhì)粒、抗體及試劑
        4.1.3 總 RNA 提取與 cDNA 的合成
        4.1.4 豬 SAMHD1 基因序列分析
        4.1.5 真核表達載體的構(gòu)建與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        4.1.6 SAMHD1 亞細胞定位與組織分布
        4.1.7 過表達 SAMHD1 對 HP-PRRSV 的影響
        4.1.8 IFA 檢測 HP-PRRSV 的增殖
        4.1.9 Strand-specific quantitative RT-PCR (qRT-PCR)檢測 HP-PRRSV 增殖
        4.1.10 干擾素刺激因子 ISG15 和 ISG56 表達量檢測
        4.1.11 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 電泳及 western blot 分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 豬 SAMHD1 基因序列分析
        4.2.2 豬 SAMHD1 亞細胞定位與組織分布
        4.2.3 過表達 SAMHD1 顯著抑制 HuN4 在 MARC-145 細胞中的增殖
        4.2.4 過表達 SAMHD1 蛋白主要以非磷酸化形式存在
        4.2.5 過表達 SAMHD1 抑制 HuN4 病毒 cRNA 鏈的合成
        4.2.6 過表達 SAMHD1 顯著上調(diào) ISG15 和 ISG56 的轉(zhuǎn)錄
    4.3 討論
第五章 SAMHD1 表達調(diào)控機制研究
    5.1 材料和方法
        5.1.1 病毒和細胞
        5.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        5.1.3 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.1.4 Real-time PCR 定量分析 SAMHD1 基因 mRNA 表達量
        5.1.5 細胞處理與轉(zhuǎn)染
        5.1.6 熒光素酶活性檢測
        5.1.7 RNA 干擾與回補實驗
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 IFN-α能顯著誘導 MARC-145 細胞和 PAM 細胞中 SAMHD1 的上調(diào)表達
        5.2.2 TLR3 和 RIG-I 通路參與 SAMHD1 上調(diào)表達
        5.2.3 TBK1 參與 SAMHD1 的誘導表達
        5.2.4 活化的 IRFs 誘導 SAMHD1 的表達
        5.2.5 NDV 感染通過磷酸化 IRF-3 上調(diào)表達 SAMHD1
        5.2.6 抑制 IRF-3 的磷酸化入核無法誘導 SAMHD1 上調(diào)表達
    5.3 討論
第六章 PRRSV 感染調(diào)控 SAMHD1 機制的研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 細胞與病毒
        6.1.2 質(zhì)粒、抗體和試劑
        6.1.3 細胞樣品收取與 real-time RT-PCR 分析 SAMHD1 mRNA 表達
        6.1.4 Phos-Tag~(TM)SDS-PAGE 電泳及 western blot
        6.1.5 免疫沉淀實驗
        6.1.6 RNA 干擾實驗
        6.1.7 抑制劑處理細胞和病毒感染
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 PRRSV 感染 MARC-145 細胞和 PAM 細胞 SAMHD1 表達具有一定的差異
        6.2.2 HuN4 感染 MARC-145 細胞抑制 IRF-3 的磷酸化
        6.2.3 HuN4 病毒感染通過阻止 IRF-3 入核來抑制 SAMHD1 的上調(diào)表達
        6.2.4 HuN4 感染 MARC-145 細胞直接抑制 IRF-3 的磷酸化
        6.2.5 HuN4 感染 PAM 細胞上調(diào) IRF-3 的磷酸化
        6.2.6 HuN4 感染 PAM 細胞通過 RIG-I/MDA5/TBK1 通路激活 IRF-3
        6.2.7 PAM 細胞中抑制 IRF-3 的磷酸化入核阻止 SAMHD1 的上調(diào)表達
        6.2.8 抑制 PAM 細胞中 SAMHD1 上調(diào)表達促進 HuN4 病毒的增殖
        6.2.9 MARC-145 細胞 SAMHD1 處于磷酸化狀態(tài)
        6.2.10 PK-15 細胞中 SAMHD1 處于磷酸化狀態(tài)
        6.2.11 MARC-145 細胞中 SAMHD1 與 CyclinA2/CDK1 互作
        6.2.12 PRRSV 感染 MARC-145 細胞促進 CDK1 的活性
        6.2.13 抑制 CyclinA2/CDK1 復合體的功能能夠阻止 HuN4 病毒的增殖
        6.2.14 干擾 MARC-145 細胞中 SAMHD1 的表達對 HuN4 增殖沒有顯著影響
        6.2.15 PRRSV 感染 PAM 細胞 SAMHD1 處于非磷酸化狀態(tài)
        6.2.16 IFN-α誘導 SAMHD1 表達以非磷酸化形式存在
    6.3 討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3392903