發(fā)布時(shí)間：2021-09-09 08:53

　　鵝細(xì)小病毒（Goose Parvovirus,GPV）是小鵝瘟的病原,易感染4-20日齡各品系的雛鵝和雛番鴨,而對(duì)其他禽類和哺乳動(dòng)物均沒有感染性。該病具有傳播速度快,發(fā)病率高和死亡率高的特點(diǎn),臨床表現(xiàn)為腹瀉、精神萎靡、食欲減退和呼吸困難。主要傳播方式主要是水平傳播和垂直傳播,水平傳播是通過消化道傳播,垂直傳播是通過種蛋傳染。該病沒有顯著的季節(jié)性,全年都有可能發(fā)生,但以冬、春季發(fā)生為主。由于該病傳播快、病程短、病死率高,是嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要疾病之一,引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。為培育鵝細(xì)小病毒鵝胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)毒株,采用在鵝胚上連續(xù)傳代的方法,培育細(xì)胞適應(yīng)毒株。本研究將原代鵝胚成纖維細(xì)胞（GEF）進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng),建立了鵝胚成纖維細(xì)胞系,并成功傳至31代次,傳代的GEF具有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài),培養(yǎng)48h后形成單層細(xì)胞。選取不同代次的GEF接種GPV YN分離株,并在GEF中連續(xù)傳代至F20代,病毒滴度由102.5TCID50/0.1mL達(dá)到106.16TCID50/0.1mL,表明GPV已適應(yīng)GEF,傳代至F12代細(xì)胞在72h后出現(xiàn)細(xì)胞病變。對(duì)細(xì)胞適應(yīng)毒F20和親本病毒F0代進(jìn)行基因序... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鵝細(xì)小病毒概述
        1.1.1 鵝細(xì)小病毒的理化特征
        1.1.2 鵝細(xì)小病毒的培養(yǎng)特征
        1.1.3 GPV的分類地位
    1.2 小鵝瘟的研究進(jìn)展
        1.2.1 小鵝瘟的流行病學(xué)特點(diǎn)
        1.2.2 小鵝瘟的臨床癥狀及病理變化
        1.2.3 小鵝瘟的診斷
        1.2.4 小鵝瘟的防治
    1.3 鵝細(xì)小病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)
        1.3.1 基因組結(jié)構(gòu)
        1.3.2 開放閱讀框及編碼區(qū)的分布
        1.3.3 GPV的結(jié)構(gòu)蛋白
        1.3.4 GPV的非結(jié)構(gòu)蛋白
    1.4 鵝細(xì)小病毒適應(yīng)株的研究進(jìn)展
        1.4.1 鵝胚和鴨胚適應(yīng)株的研究進(jìn)展
        1.4.2 成纖維細(xì)胞適應(yīng)株的研究進(jìn)展
    1.5 細(xì)胞系的概述
        1.5.1 細(xì)胞系、細(xì)胞株及克隆
        1.5.2 二倍體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
    1.6 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 引物設(shè)計(jì)及序列分析軟件
        2.1.5 主要試劑的配置
    2.2 鵝胚成纖維細(xì)胞系的建立
        2.2.1 鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)的制備
        2.2.2 GEF的傳代及純化
        2.2.3 GEF的凍存與復(fù)蘇
    2.3 鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒株的培育
        2.3.1 GEF細(xì)胞接種鵝細(xì)小病毒
        2.3.2 PCR檢測(cè)
        2.3.3 GEF細(xì)胞中病毒增殖檢測(cè)
        2.3.4 半數(shù)感染量(TCID_(50))的測(cè)定
    2.4 全基因組的擴(kuò)增及序列分析
        2.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.4.2 全基因組擴(kuò)增
        2.4.3 PCR產(chǎn)物的純化
        2.4.4 PCR產(chǎn)物與pMD-18T的載體的連接
        2.4.5 氯化鈣法制備DH5α
        2.4.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.4.7 pMD-18T載體克隆質(zhì)粒的提取
3 結(jié)果
    3.1 鵝胚成纖維細(xì)胞系的建立
        3.1.1 原代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況
        3.1.2 傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況
        3.1.3 細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇
    3.2 鵝細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)毒株的培育
        3.2.1 顯微鏡觀察CPE
        3.2.2 PCR檢測(cè)
        3.2.3 GEF細(xì)胞中的病毒增殖檢測(cè)
        3.2.4 TCID_(50)測(cè)定結(jié)果
    3.3 全基因組序列分析
        3.3.1 全基因組擴(kuò)增
        3.3.2 核苷酸序列分析
        3.3.3 推導(dǎo)的氨基酸序列分析氨基酸
4 討論
    4.1 鵝胚成纖維細(xì)胞系的建立
    4.2 GPV細(xì)胞適應(yīng)株的培育
        4.2.1 小鵝瘟疫苗的研究進(jìn)展
        4.2.2 細(xì)胞適應(yīng)株的培育
        4.2.3 細(xì)胞適應(yīng)株的特點(diǎn)
    4.3 全基因組序列分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗鵝細(xì)小病毒卵黃IgG的制備及其間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 劉菲,唐衛(wèi)杰,程安春,汪銘書,趙婷婷,韓清林,高麗芹.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2011(06)
[2]板藍(lán)根多糖對(duì)小鵝瘟病毒體外抑制作用的觀察[J]. 李青,許小琴,王志剛,王彬.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2009(09)
[3]7株鵝細(xì)小病毒的克隆序列分析與分子特性[J]. 劉中勇,李福偉,曹宗喜,李惠敏,吳玄光,張桂紅.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2009(07)
[4]用于檢測(cè)小鵝瘟抗體的Dot-ELISA建立[J]. 布日額,王君偉,吳金花.  中國(guó)家禽. 2009(11)
[5]黃芪多糖及其與抗小鵝瘟卵黃抗體協(xié)同作用防治小鵝瘟病的研究[J]. 馮敏,楊春華,羅天瑤,戴麗梅,李廣運(yùn),穆永才.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問. 2009(03)
[6]小鵝瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 付薇,潘杰,龍劍明,朱偉,胡曉靜,馮淑萍,何丹,熊毅.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2008(06)
[7]小鵝瘟病毒常州株的鑒定及其致弱研究[J]. 金文杰,李清,劉岳龍,秦愛建,劉學(xué)賢,王建,邵紅霞,施祖灝,蔣小剛,周衛(wèi)東.  中國(guó)家禽. 2008(23)
[8]鵝和番鴨細(xì)小病毒全基因克隆與序列分析[J]. 張?jiān)?耿宏偉,郭東春,胡奇林,相文華,劉明,楊濤,林巍.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(06)
[9]鵝細(xì)小病毒研究進(jìn)展[J]. 劉洪雨,王君偉,張君,劉玉芬,董飛.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2005(08)
[10]鵝細(xì)小病毒弱毒株選育的研究[J]. 陳少鶯,胡奇林,程曉霞,李怡英,程由銓.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2002(04)

博士論文
[1]GPV VP及NS基因克隆及其原核表達(dá)產(chǎn)物的研究和應(yīng)用[D]. 布日額.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]小鵝瘟細(xì)胞適應(yīng)毒的培育及其特性的研究[D]. 劉兵.揚(yáng)州大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3391801