豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（Postweanig multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原,也可導(dǎo)致免疫抑制,引起其它相關(guān)疾病的并發(fā)和繼發(fā)感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫接種是預(yù)防PCV-2的主要措施,免疫豬群中仍會存在野毒感染的豬。要將其從免疫豬群中淘汰,必須要建立能大規(guī)模鑒別野毒感染的方法。本研究的目的就是建立檢測PCV-2野毒感染抗體的ELISA方法。為鑒定PCV-2 ORF3蛋白的抗原性,本實驗首先將ORF3基因插入pT7-IRES表達(dá)載體,使用體外無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)進行蛋白表達(dá),用PCV-2野毒感染豬的血清對表達(dá)蛋白的抗原性進行Western-blot鑒定。為獲得大量的表達(dá)蛋白進行純化和ELISA方法的建立,將其插入pET-28a表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,鑒定后進行純化,隨后用其作為包被抗原建立間接ELISA,并對臨床野毒感染樣品進行了檢測。試驗結(jié)果表明,PCV-2 ORF3基因被插入pT7-IRES表達(dá)載體,構(gòu)建成功pT7-PCV-2-O... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PCV2ORF3基因的擴增Figure2-1PCRamplificationofPCV2ORF3geneM.2000bpDNAMarker；1.陰性對照；2.PCR產(chǎn)物M.2000bpDNAMarker；1.negativecontrol；2.PCR

ES 質(zhì)粒的線性化2 所示：將 pT7-IREF 質(zhì)粒酶切后進行膠回收，在 3300bp 處出條帶，說明成功將 pT7-IRES 質(zhì)粒線性化。達(dá)質(zhì)粒的鑒定成功的菌株過夜培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行 PCR 和雙酶泳觀察，如圖 2-3，PCR 結(jié)果顯示擴增出單獨一條 315bp 條帶 3300bp 和 315bp 兩條核酸條帶。結(jié)果說明成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)R amplification of PCV2 ORF3 geneNA Marker；1.陰性對照；2.PCR 產(chǎn)物NA Marker；1.negative control；2.PCRamplification products圖 2-2 pT7-IRES 質(zhì)粒的線性Fig.2-2 Linearization of pT7-IRESM.5000bp DNA Marker；1.pT7-IRES 質(zhì)M.5000bp DNA Marker；1.LinearizpT7-IRES plasmids

Western-Blot 鑒定考馬斯亮藍(lán)染色條帶大約 13.5K以看到陽性樣品PAGE 和 Western-的制備 2-3 質(zhì)粒雙酶切ble enzyme digestionDNA Marker;1.PCR 擴增Marker;1.PCR amplificatdigestion

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3390787